Kuwanon T y Sanggenon A aislados de Morus Alba ejercen efectos antiinflamatorios al regular las vías de señalización de NF-κB y HO-1/Nrf2 en células BV2 y RAW264.7

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Resumen: Previamente investigamos el extracto metanólico de la corteza de Morus alba y caracterizamos 11 compuestos del extracto: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofurano B(7), mulberofurano G(8), moracina M(9), moracina O(10) y norartocarpanona (11). En este documento, investigamos laantiinflamatorioefectos de estos compuestos sobre células microgliales (BV2) y macrófagos (RAW264.7). Entre ellos, 3 and 4 inhibieron notablemente la producción de óxido nítrico inducida por lipopolisacáridos (LPS) en estas células, lo que sugiere las propiedades antiinflamatorias de estos dos compuestos. Estos compuestos inhibieron la producción de prostaglandina E2, interleucina-6 y factor de necrosis tumoral-c, y la expresión de óxido nítrico sintasa inducible y ciclooxigenasa-2 después de la estimulación con LPS. El pretratamiento con 3 y 4 inhibió la activación de la vía de señalización del factor nuclear kappa B en ambos tipos de células. Los compuestos también indujeron la expresión de hemo oxigenasa (HO)-1 a través de la activación del factor 2 relacionado con el factor eritroide 2-nuclear. La supresión de la actividad de HO-1 revirtió los efectos antiinflamatorios causados por pretratamiento con 3 y 4, lo que sugiere que los efectos antiinflamatorios estaban regulados por HO-1. En conjunto, 3 y 4 son candidatos potenciales para desarrollar agentes terapéuticos y preventivos paraenfermedades inflamatorias.

Palabras clave: Morus alba; kuwanon T; sanggenón A; BV2; células RAW264.7; efectos antiinflamatorios

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1. Introducción

Morus alba, una planta medicinal perteneciente a la familia Moraceae, se ha utilizado para el tratamiento de afecciones inflamatorias pulmonares en la medicina tradicional [1]. La corteza de su raíz contiene varios componentes activos como umbeliferona, escopoletina, mucinas, taninos,flavonoides(morusina, morerina, mulberricoromeno, ciclomulberrina, moracina P, moracina O, mulberrofurano Q, Kuwana E y kuwanon H)[2], 2-arilbenzofuranos (moracenina D, moracina P, moracina O y mulberrofurano O), y flavonoides prenilados (licoflavona C, ciclomulberrina, neociclomorusina, sanggenon I, morusina y Kuwana U)[3,4]. Los extractos y compuestos activos de M. alba pueden aliviar las enfermedades pulmonares, como lo revelan estudios recientes [5-7]. Además del efecto farmacológico de M. alba en los pulmones, los flavonoides isoprenilados (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G y mulberrofuran C) ejercen efectos hepatoprotectores en las células HepG2 inducidas por t-BHP [8]. Los prenil-flavonoides (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T y morusina) y los triterpenoides (ácido de betulina, aval y -sitosterol) inhiben sustancialmente la diferenciación de los adipocitos 3T3-L1 [9]. El hidrato de morina, el principal componente flavonoide de M. alba, alivia el deterioro de la memoria crónico e impredecible inducido por el estrés, lo que indica que este compuesto podría estimular el sistema de defensa antioxidante e inhibir las vías neuroinflamatorias [10]. Estos estudios sugieren que los componentes contenidos en M.alba son candidatos potenciales para el tratamiento de diversas enfermedades.

Inflamación, una respuesta compleja de autodefensa a los estímulos dañinos, desempeña un papel importante en la defensa inmunitaria a través de la activación de varias células inmunitarias, incluidos macrófagos, monocitos, leucocitos, mastocitos y otros tipos de células [11]. Los macrófagos son las células inmunes más abundantes y ampliamente distribuidas en el cuerpo, y la microglía son macrófagos residentes en el sistema nervioso central (SNC) [12]. Los macrófagos y las células microgliales son actores clave en la respuesta inflamatoria. Pueden activarse en respuesta a estímulos como los lipopolisacáridos (LPS), las citocinas y las quimiocinas, e inducir estados inflamatorios [13]. En condiciones inflamatorias, los macrófagos y las células microgliales excesivamente activados provocan una regulación anormal de los mediadores proinflamatorios (óxido nítrico (NO), prostaglandina E2 (PGE), óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa (COX)-2 ) y citocinas proinflamatorias (interleucina (IL)-6 y factor de necrosis tumoral (TNF)-a), a través de la activación de la vía de señalización del factor nuclear kappa B (NF-B)[14,15]. El aumento de los niveles de mediadores proinflamatorios exacerba aún más la progresión de las enfermedades inflamatorias, lo que aumenta aún más la activación de los factores inflamatorios, lo que da como resultado un círculo vicioso[16]. Por lo tanto, la regulación de los mediadores inflamatorios es esencial para el tratamiento y prevención de enfermedades inflamatorias.

La hemooxigenasa (HO)-1 es una enzima limitante de la velocidad que cataliza la degradación del hemo en biliverdina, iones ferrosos (Fe2 plus) y monóxido de carbono (CO)[17]. La inducción de HO-1 está regulada por la activación del factor nuclear eritroide 2-relacionado con el factor 2 (Nrf2). HO-1 se puede inducir en respuesta al estrés oxidativo y la inflamación para proteger los tejidos y mantener la homeostasis en el cuerpo [18]. Por lo tanto, apuntar a la inducción de HO-1 es una de las estrategias potenciales para tratar enfermedades inflamatorias.

En nuestro esfuerzo continuo por explorar candidatos de productos naturales para tratar enfermedades inflamatorias, aquí presentamos elefectos antiinflamatoriosde 111 compuestos aislados de M. alba en células BV2 y RAW264.7 inducidas por LPS.

2. Resultados

2.1.Efectos de 11 compuestos aislados de M.alba sobre la viabilidad de células BV2 y RAW264.7

En el estudio anterior, la corteza de la raíz de M. alba se extrajo en metanol acuoso y los extractos obtenidos se dividieron sucesivamente en EtOAc, n-BuOH y H2O2. La cromatografía en columna repetida de SiO2, ODS y Sephadex LH-20 de la fracción de EtOAc proporcionó 11 compuestos, como kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofurano B(7), mulberofurano G(8), moracina M(9), moracina O(10) y norartocarpanona (11)[6,19,20]. Las estructuras químicas de 11 compuestos aislados de M. alba se ilustran en la Figura 1. Para determinar los efectos citotóxicos de estos compuestos, un 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){{ 26}}.5-Se realizó el ensayo de bromuro de difeniltetrazolio (MTT), las células BV2 y RAW264.7 se trataron con las concentraciones indicadas de los compuestos durante 48 h, en concentraciones de hasta 80 μM. (Figura 2). Los compuestos 2, 3 y 4 tuvieron efectos tóxicos a 80 μM, el compuesto 5 tuvo efectos tóxicos a 40 μM. Con base en el resultado de la evaluación de toxicidad, se seleccionó un rango de concentración no tóxico para estudios posteriores sobre los efectos antiinflamatorios (compuesto 2, 3,4 a 40 uM, compuesto 5 a 200 μM y otros compuestos a 80 μM） .

2.2.Efectos de los compuestos l1 aislados de M. alba sobre la expresión de factores inflamatorios y proteína iNOS en células BV2 y RAW264.7

El NO es un radical libre en el sistema cardiovascular, nervioso ysistema inmune. Mantiene la homeostasis intracelular, transporta neurotransmisores y regula la actividad antiinflamatoria y la citotoxicidad. Sin embargo, cuando se produce una gran cantidad de NO, tiene efectos perjudiciales en el organismo, como vasodilatación, citotoxicidad y daño tisular [21,22]. Luego examinamos los efectos de estos compuestos en la producción de nitrito en células BV2 y RAW264.7 inducidas por LPS. Las células se trataron con diferentes concentraciones de compuestos durante 2 h antes de la estimulación con LPS (1 ug/mL) durante 24 h. Entre los compuestos, solo el Compuesto 3 (kuwanonT) y 4 (sanggenon A) inhibieron significativamente la producción de nitrito en las líneas celulares BV2 y RAW264.7 (Figura 3). Además, realizamos un experimento adicional para comparar el efecto inhibitorio de la producción de nitrito entre el grupo tratado con LPS después del pretratamiento con el compuesto y el grupo tratado con el compuesto después del pretratamiento con LPS. Como resultado, no hubo diferencia en el efecto inhibidor de la producción de nitrito entre los dos grupos experimentales (Figura complementaria S1). Por lo tanto, en este estudio, se realizaron los siguientes experimentos utilizando el pretratamiento con compuestos dentro de las 2 a 3 horas antes de tratar con LPS.

La producción de NO se ve incrementada por la óxido nítrico sintasa inducible por proteínas proinflamatorias (iNOS). Sin embargo, la sobreexpresión de iNOS afecta seriamente la fisiopatología de la enfermedad [23]. Los compuestos 3 y 4 inhibían la expresión de iNOS de forma dependiente de la concentración (Figura 4). Examinamos los efectos de los compuestos 3 y 4 sobre la expresión de factores inflamatorios inducida por LPS en células BV2 y RAW264.7. Las células se trataron con diferentes concentraciones de los compuestos 3 y 4 durante 2 h antes de la estimulación con LPS (1 ug/mL) durante 24 h. Ambos compuestos inhibieron significativamente la expresión de PGE2, TNF e IL-6 inducida por LPS en células BV2 y RAW264.7 (Figura 5). Los resultados parecían mostrar que el tratamiento previo con los compuestos 3 y 4 suprimió la inflamación inducida por LPS en las células BV2 y RAW264.7.

2.3.Efectos de los compuestos 3 y 4 sobre la translocación de NF-xB en células BV2 y RAW264.7

NF-kB es un factor de transcripción que regula la expresión de iNOS [24]. El NF-kB normal permanece en su forma inactiva formando complejos con proteínas reguladoras como IKB. Sin embargo, cuando es activado por LPS, IkBa se degrada por fosforilación y NF-kB (como p65) se transloca al núcleo [25], lo que promueve el gen mediador inflamatorio e induce la expresión de factores inflamatorios [26]. Para examinar más a fondo el efecto inhibitorio de los compuestos 3 y 4 sobre la producción de factores proinflamatorios en células BV2 y RAW264.7 activadas con LPS, investigamos la translocación nuclear de expresión de p65 en células tratadas con compuestos 3 y 4, LPS o ambos usando un anticuerpo anti-p65 marcado con FITC. Se usó DAPI para la tinción nuclear. En el grupo de control, se detectó expresión de p65 en el citosol. Sin embargo, en las células inducidas por LPS, se detectó acumulación de p65 en el núcleo, como se indica en las imágenes combinadas de tinción de DAPI y p65. Además, en comparación con las células inducidas por LPS, los compuestos 3 y 4 redujeron notablemente el aumento mediado por LPS en la actividad de unión al ADN de NF-KB (p65) (Figura 6A, B) y la translocación nuclear (Figura 6C-F). Estos hallazgos indican que los compuestos 3 y 4 son reguladores negativos de la translocación nuclear de NF-kB estimulada por LPS.

2.4.Efectos de los compuestos 3 y 4 en la vía Nrf2/HO-1 en BV2 y RAW264.7

Células La hemooxigenasa-1(HO-1)es un objetivo del factor nuclear E2-factor relacionado 2(Nrf2), la vía Nrf2/HO-1 es un poderoso sistema de señalización antioxidante para promover el hierro libre en monóxido de carbono (CO), biliverdina y hemo [27]. El monóxido de carbono, un metabolito gaseoso del catabolismo del hemo, exhibe efectos reguladores de vasodilatación y respuestas proinflamatorias [28]. Además, también se sabe que el HO-1 desempeña un papel importante en la protección de las células contra la inflamación y el estrés oxidativo y en la regulación de la producción de nitritos en los macrófagos activados [29]. Realizamos transferencias de Western para investigar si los compuestos 3 y 4 aumentan el nivel de expresión de HO-1, en el que se usó el conocido inductor de HO-1 protoporfirina de cobalto (CoPP) como control positivo que aumenta HO{{ 16}} expresión de proteínas. [30]. Los resultados revelaron que los compuestos 3 y 4 también aumentaron la expresión de HO-1 (Figura 7). Exploramos más a fondo si los compuestos 3 y 4 regulan la activación de Nrf2. La translocación de Nrf2 al núcleo aumentó de manera dependiente del tiempo, lo que indica que los compuestos 3 y 4 aumentaron significativamente la vía Nrf2/HO-1 en células BV2 y RAW264.7 (Figura 8).

Para examinar más a fondo si los efectos antineuroinflamatorios y antiinflamatorios de los compuestos 3 y 4 están correlacionados con la expresión de HO-1 en células BV2 y RAW264.7, realizamos una serie de experimentos con protoporfirina-IX de estaño (SNPP) que es un inhibidor selectivo de la actividad de HO-1. Usando SNPP que puede regular a la baja la expresión de HO-1, intentamos determinar si HO-1 media el efecto inhibitorio de los compuestos anteriores sobre la respuesta inflamatoria inducida por LPS 【31】. Después de tratar las células con 20 μM de los compuestos 3 y 4 durante 2 horas con o sin 50 μM de SNPP, se trataron con LPS durante 24 horas. Aunque los compuestos 3 y 4 redujeron la producción de nitrito en células BV2 y RAW264.7 inducidas por LPS, sus efectos antiinflamatorios se revirtieron mediante el tratamiento con SNPP (Figura 9). SNPP solo no afectó la producción de óxido nítrico (NO) después de la estimulación con LPS, lo que sugiere que los efectos antiinflamatorios de los compuestos 3 y 4 están regulados por la expresión de HO-1.

3. Discusión

El presente estudio demostró que Kuwana T y sanggenon A ejercen una inflamación inducida por LPS suprimida en células BV2 y RAW264.7. Estos compuestos inhibieron la producción inducida por LPS de NO, PGE2 y citoquinas proinflamatorias, incluidas IL-6 y TNF-, y la expresión de iNOS y COX-2 en células BV2 y RAW264.7. Estos resultados indicaron que Kuwana T y sanggenon A ejercieron sus efectos antiinflamatorios al inactivar la vía de señalización de NF-kB. Además, estos compuestos indujeron la expresión de HO-1 a través de la activación de Nrf2. Además, estos compuestos indujeron la expresión de HO-1 a través de la activación de Nrf2, y también se confirmó que este efecto está relacionado con la actividad antiinflamatoria.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), y tromboxano A2(TXA,)[361. En condiciones inflamatorias, los niveles de iNOS y COX-2 aumentan, lo que da como resultado la sobreproducción de NO y PGE2, respectivamente, y conduce a la exacerbación de los trastornos inflamatorios [37]. En el presente estudio, primero evaluamos 11 compuestos aislados de M. alba para determinar si la producción de NO se inhibe en células BV2 y RAW264.7 estimuladas con LPS. Nuestros resultados mostraron que kuwanon T y sanggenon A ejercieron los efectos inhibidores más fuertes en las células BV2 y RAW264.7 (Figura 3). En nuestro estudio anterior, la moracina M tuvo un efecto antiinflamatorio en los macrófagos alveolares, pero nuestros resultados mostraron un efecto diferente. patrón. Sin embargo, dado que cada célula tiene características diferentes, pueden aparecer actividades diferentes incluso con el mismo mecanismo J38]. Por lo tanto, al igual que en los resultados de este trabajo, se confirmó que la moracina M no tenía actividad antiinflamatoria en las células BV2 y RAW264.7 hasta la concentración de tratamiento. Por lo tanto, se seleccionaron kuwanon T y sanggenon A para experimentos adicionales.

Las citocinas tienen una influencia reguladora compleja sobre las respuestas inflamatorias e inmunitarias [39]. La activación de macrófagos y células microgliales aumenta la secreción de citocinas proinflamatorias J40, y este aumento de la secreción conduce a una mayor liberación de citocinas [41]. IL-6 es una de las principales citocinas y es un mediador soluble responsable de la inflamación, la respuesta inmunitaria y la hematopoyesis [42]. La señalización de IL-6 se regula a través de dos mecanismos diferentes, incluida la unión al receptor de IL-6 unido a la membrana (mblL6R) y el reconocimiento del receptor soluble de IL-6 (sIL6R)[43]. Ambos mecanismos están asociados con la activación de la glicoproteína (GP) 130, que da como resultado la activación de moléculas de señalización aguas abajo, incluida la Janus quinasa (IAK)/transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) quinasas, fosfoinositida 3- quinasa (PI3K ), y proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) [44]. IL-6 se utiliza para predecir y evaluar los niveles de inflamación en pacientes con cáncer, infección, enfermedades autoinmunes, enfermedades pancreáticas y enfermedades cardiovasculares.

TNF-, otra citocina importante, también desempeña un papel importante en muchos procesos inmunitarios e inflamatorios, como la proliferación de células inmunitarias, la apoptosis, la necrosis y la supervivencia. Los efectos biológicos del TNF- están regulados por la unión a dos receptores diferentes, el receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR)1 y el TNFR2. TNFR1 es el principal mediador de la actividad de TNF- en la mayoría de las células, porque TNFR2 tiene menos afinidad de unión por TNF-, lo que hace que TNF- se disocie más fácilmente de TNFR2 que de TNFR1. Las anomalías en la señalización del TNF- y la sobreproducción de TNF- conducen al desarrollo de muchas enfermedades, como la artritis reumatoide, la psoriasis, la enfermedad de Crohn, la aterosclerosis, la sepsis, la diabetes y la obesidad [45,46]. Por lo tanto, es importante inhibir la producción de citocinas proinflamatorias para suprimir y prevenir las reacciones inflamatorias y el desarrollo de enfermedades inflamatorias. En el presente estudio, kuwanon T y sanggenon A inhibieron la producción inducida por LPS de IL-6 y TNF- en células BV2 y RAW264.7.

NF-KB es el factor de transcripción más ubicuo[47], y la señalización de NF-kB desempeña un papel importante en la expresión de genes relacionados con respuestas inflamatorias, incluidos los que codifican iNOS, COX-2 y citoquinas proinflamatorias [ 48]. En estado inactivo, las subunidades NF-kB existen en el citoplasma unidas a su proteína inhibidora, el inhibidor kappa B (kB)-. Varios estímulos, incluidos LPS y citoquinas, inducen la fosforilación y degradación de IkB-, lo que permite la liberación y translocación de subunidades de NF-kB en el núcleo. Las subunidades translocadas se unen a sitios kB de genes diana en el ADN, lo que da como resultado la inducción de la transcripción de genes que codifican mediadores proinflamatorios [49]. Por tanto, la inactivación de la vía NF-kB puede ser una diana terapéutica para enfermedades inflamatorias. En el presente estudio, el pretratamiento con kuwanon T y sanggenon A inhibió la activación de la señalización de NF-kB inducida por LPS al inhibir la actividad de unión al ADN y la translocación nuclear de las subunidades de NF-kB (Figura 6). Estos resultados sugieren que los efectos antiinflamatorios de kuwanon T y sanggenon A se ejercen mediante la regulación de la vía de señalización de NF-kB.

En condiciones normales, Nrf2 se une a la proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (Keap1) en el citoplasma. Sin embargo, se disocia de Keapl, se traslada al núcleo y se une a los sitios del elemento de respuesta antioxidante (ARE) en el ADN, lo que lleva a la expresión de varios genes antioxidantes, incluidos los que codifican HO-1, NAD(P)H : quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), peroxirredoxina (Prx) y tiorredoxina (Trx)[50]. En particular, se sabe que el HO-1 está asociado con efectos antiinflamatorios, y su actividad está representada por los niveles de CO, uno de los tres subproductos generados a partir del hemo por la actividad enzimática del HO{{12 }} [51]. En el presente estudio, encontramos que kuwanon T y sanggenon A inducían la expresión de HO-1 al activar Nrf2 (Figuras 7 y 8). Además, verificamos la correlación entre el efecto antiinflamatorio de kuwanon T y sanggenon A y la expresión de HO-1 usando SNPP, un inhibidor selectivo de la actividad de HO-1. Los efectos inhibitorios de kuwanon T y sanggenon A sobre la producción de NO y TNF y la activación de NF-kB se revirtieron parcialmente mediante el tratamiento conjunto con SNPP (Figura 9). Estos resultados sugieren que los efectos antiinflamatorios de kuwanon T y sanggenon A están regulados por la expresión de HO-1.

4. Materiales y Métodos

4.1. Materiales

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) y suero fetal bovino se adquirieron de Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, EE. UU.). Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). Los anticuerpos primarios anti-iNOS, anti- -actina, anti-p65 y anti-HO-1 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.); y anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón de Millipore

(Billerica, MA, EE. UU.). Los kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para PGE, IL-6 y TNF- se adquirieron de R&DSystems Inc. (Minneapolis, MN, EE. UU.). El aislamiento y determinación estructural de los 11 compuestos de Morus alba se ha descrito en otra parte [19-21].

4.2. Ensayos de cultivo celular y viabilidad

Se sembraron células BV2 y RAW264.7 a una densidad de 5 × 105 células/mL en RPMI 1640 complementado con 1 por ciento de antibiótico (penicilina-estreptomicina) y 10 por ciento de FBS inactivado por calor. Las células se cultivaron a 37 grados en un 5 por ciento de CO humidificado, con una atmósfera de aire del 95 por ciento, de acuerdo con un método descrito previamente [52].

4.3. Medición de la producción de NO

La producción de nitrito, un producto final estable de la oxidación de NO, se midió como indicador de la producción de NO en las células. Brevemente, la concentración de nitrito en los medios acondicionados se determinó utilizando un método basado en la reacción de Griess [53]. Los detalles del ensayo se han descrito previamente [54].

4.4. Ensamblaje PGE24y/

La concentración de PGEz en cada muestra se midió usando un kit ELISA comercialmente disponible, según un método descrito previamente [55].

4.5.Medición de los niveles de IL-6 y TNF-a

Se recolectó el medio de cultivo para determinar los niveles de IL-6 y TNF- utilizando un kit disponible comercialmente (BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células BV2 y RAW264.7 se sembraron en 24-placas de cultivo de pocillos a una densidad de 20 × 10 células/pocillo. Después de la incubación, se recogió el sobrenadante y se utilizó para medir las concentraciones de IL-6 y TNF- con kits ELISA.

4.6. Análisis de Western Blot

Las células BV2 y RAW264.7 sedimentadas se lavaron con PBS y se lisaron en tampón RIPA. Se cuantificaron cantidades iguales de proteínas utilizando concentrado de reactivo de colorante de ensayo de proteínas obtenido de Bio-Rad Laboratories (n.º 5000006; Hercules, CA, EE. UU.), se mezclaron en el tampón de carga de muestras y se separaron mediante SDS-PAGE. A continuación, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La unión no específica a la membrana se bloqueó mediante incubación en una solución de leche desnatada. La membrana se incubó con anticuerpos primarios (todos los cuales se usaron a 1:1000) a 4 grados durante la noche y luego se hizo reaccionar con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (todos los cuales se usaron a 1:5000) (Millipore) [ 31].

4.7.Localización de NF-xB y análisis de inmunofluorescencia

Para estudiar la localización de NF-kB, se cultivaron células BV2 y RAW264.7 en portaobjetos de cámara Lab-Tek II y se trataron con diferentes concentraciones de compuestos durante 2 h antes de la estimulación con LPS (0,5 ug/mL) durante 1 H. Luego, las células se fijaron en formalina y se permeabilizaron con acetona fría y se probaron con anticuerpos anti-p65 (1:200), seguido de incubación con un anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). Para visualizar los núcleos, las células se trataron con 1 ug/mL de 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 30 min, se lavaron con PBS durante 5 min y se trataron con 50 μL de VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Las células teñidas se visualizaron y las imágenes se adquirieron usando un microscopio de fluorescencia Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokio, Japón). [31].

4.8. Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Se utilizó el análisis de varianza de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey, para comparar las diferencias entre los tres grupos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.),

5. Conclusiones

Kuwanon T y sanggenon A ejercieron efectos antiinflamatorios en las células BV2 y RAW264.7 inducidas por LPS al inhibir la producción de NO, PGE2, IL-6 y TNF- y la expresión de iNOS y COX{{8} }. Nuestros resultados demostraron que estos efectos inhibitorios estaban mediados por la inactivación de la vía NF-KB mediante el tratamiento con kuwanon T y sanggenon A. Además, estos compuestos inducían la expresión de HO-1 al activar la translocación de Nrf2 en el núcleo. . Nuestros hallazgos demostraron que la expresión de HO-1 inducida por kuwanon T y sanggenon A se asoció con los efectos supresores contra la inflamación inducida por LPS. En conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia de que Kuwana T y sanggenon A aislados de M. Albu podrían ser candidatos para el desarrollo de agentes terapéuticos y preventivos para enfermedades neuroinflamatorias como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.