La peroxidación lipídica lisosomal regula la inmunidad tumoral

La inhibición lisosomal provocada por inhibidores de la palmitoil-proteína tioesterasa 1 (PPT1), como el DC661, puede producir la muerte celular, pero el mecanismo para esto no se comprende completamente. No se requirieron vías de muerte celular programada (autofagia, apoptosis, necroptosis, ferroptosis y piroptosis) para lograr el efecto citotóxico de DC661. La inhibición de las catepsinas o la quelación del hierro o el calcio no rescató la citotoxicidad inducida por las DC661-. La inhibición de PPT1 indujo la peroxidación lipídica lisosomal (LLP), lo que condujo a la permeabilización de la membrana lisosomal y a la muerte celular que podría revertirse con el antioxidante N-acetilcisteína (NAC), pero no con otros antioxidantes de peroxidación lipídica. El transportador lisosomal de cisteína MFSD12 fue necesario para el transporte intralisosomal de NAC y el rescate de LLP. La inhibición de PPT1 produjo inmunogenicidad intrínseca de las células con expresión superficial de calreticulina que solo pudo revertirse con NAC. Las células tratadas con DC661-prepararon células T vírgenes y mejoraron la toxicidad mediada por células T. Los ratones vacunados con células tratadas con DC661-generaron inmunidad adaptativa y rechazo tumoral en tumores "inmunes calientes", pero no en tumores "inmunes fríos". Estos hallazgos demuestran que la LLP impulsa la muerte celular lisosomal, una forma inmunogénica única de muerte celular, lo que señala el camino hacia combinaciones racionales de inmunoterapia e inhibición lisosomal que pueden probarse en ensayos clínicos.

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Introducción

Con una actividad alentadora en ensayos clínicos que involucran el inhibidor lisosomal hidroxicloroquina (HCQ) (1), la identificación de la palmitoil-proteína tioesterasa 1 (PPT1) como objetivo molecular de los derivados de la cloroquina (2) y el lanzamiento de nuevos inhibidores de PPT1 en el ámbito clínico. ensayos (3, 4), es necesario comprender el mecanismo por el cual los inhibidores lisosomales inducen la muerte celular y el efecto de la inhibición lisosomal sobre la inmunidad tumoral. El mecanismo canónico de muerte celular lisosomal descrito para HCQ implica la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP), la fuga de catepsinas y la activación de la apoptosis mediada por caspasa (5, 6). Anteriormente hemos demostrado que el inhibidor lisosomal DC661 penetra en las células en el microambiente ácido del tumor y se localiza en el lisosoma de manera más eficiente que la HCQ (2, 7). DC661 produce una potente muerte celular en muchas líneas celulares cancerosas (2). DC661 se une e inhibe PPT1, desacidifica el lisosoma e inhibe la autofagia. DC661 también induce FUM y aumenta los niveles de caspasa 3 escindida (2, 7). En los últimos años, se han definido nuevos mecanismos de muerte celular que tienen consecuencias inmunogénicas e incluyen necroptosis, ferroptosis y piroptosis (8). Se ha demostrado que la autofagia dependiente de lisosomas degrada el MHC de clase I (9), así como los componentes del inmunoproteasoma (10), lo que sugiere que la inhibición de la autofagia puede mejorar el procesamiento de antígenos. Sin embargo, los efectos inmunogénicos de la inhibición lisosomal y la consiguiente muerte celular no se han caracterizado completamente. Para abordar esta brecha de conocimiento, investigamos los efectos de DC661 sobre los mecanismos canónicos de muerte celular para determinar si la muerte celular lisosomal es su forma de muerte celular o simplemente un precursor de uno de los otros mecanismos establecidos. Descubrimos que HCQ y DC661 indujeron un aumento significativo en solo una pequeña cantidad de proteínas en el proteoma del melanoma y la mayoría de ellas eran proteínas relacionadas con la autofagia y la apoptosis. Los inhibidores de la muerte celular programada (apoptosis, necroptosis, ferroptosis y piroptosis) no mitigaron los efectos citotóxicos después del deterioro lisosomal por DC661. La peroxidación lipídica lisosomal (LLP) es un importante impulsor de la muerte celular inducida por LMP asociada con la expresión de calreticulina (CALR) en la superficie celular. Esta forma de muerte celular sólo puede revertirse mediante el uso del antioxidante N-acetilcisteína (NAC). La actividad de NAC se vio afectada por la inhibición del importador de cisteína lisosomal MFSD12. La LLP provocó fenotipos inmunogénicos que promueven la muerte mediada por células T. Estos hallazgos demuestran que la muerte de las células lisosomales es una forma potencialmente única de muerte celular inmunogénica.

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Resultados

La inhibición lisosomal induce cambios significativos en el proteoma asociados con la autofagia y la apoptosis. Para establecer los efectos citotóxicos de los inhibidores lisosomales, evaluamos la viabilidad de líneas celulares de melanoma A375P, carcinoma de colon RKO y líneas celulares de cáncer de páncreas MIA PaCa-2 tratadas con el inhibidor vacuolar H+-ATPasa bafilomicina-A1 (1 00 nM); Inhibidores de PPT1 DC661 (3 µM) o HCQ (10 µM o 30 µM); fluoruro de hexadecilsulfonilo mimético de palmitato (HDSF; 60 µM); inhibidores de catepsina pepstatina A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml) o PepA+E64; y bromhidrato de éster metílico de Leu-Leu, disruptor de membrana lisosomal (20 µM) durante 48 horas. Solo la bafilomicina-A1 y DC661 causaron una disminución significativa en la viabilidad celular en las líneas celulares cancerosas (Figura 1A y Figura 1A complementaria; material complementario disponible en línea con este artículo; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), y DC661 produjo una reducción más profunda en la viabilidad celular que la bafilomicina-A1. Con base en estos datos y las propiedades farmacológicas similares a las de los derivados de la cloroquina, centramos nuestro estudio en los derivados de la cloroquina como herramientas para comprender la muerte celular lisosomal. Se aplicó un análisis de proteoma global imparcial a células de melanoma A375P tratadas con DC661 (3 μM) o HCQ menos potente (10 μM o 30 μM) durante 24 horas. De las 4264 proteínas cuantificadas con alta confianza, sólo 87 y 55 proteínas aumentaron significativamente con DC661 (3 μM) y HCQ (30 μM), respectivamente; Además, 14 y 15 proteínas disminuyeron significativamente con DC661 (3 μM) y HCQ (30 μM), respectivamente (cambio absoluto superior a 2; q < 0,05) con DC661 (3 μM) o HCQ (30 μM), respectivamente. , en comparación con el control de vehículos. La dosis más baja de HCQ (10 μM) no mostró cambios proteicos significativos en comparación con el control del vehículo. Las 50 proteínas principales que aumentaron significativamente después del tratamiento con DC661 se asociaron principalmente con la autofagia y la apoptosis, y se observaron cambios similares para la dosis más alta de HCQ (Figura 1B). Por estas razones, decidimos centrar más estudios en el DC661, más potente. Ejemplos de algunos de los cambios proteicos más importantes asociados con la autofagia y la apoptosis fueron la proteína de unión a impuestos 1 (TAX1BP1; aumentada 15-veces); BCL2-proteína 3 que interactúa (BNIP3; aumentada 6-veces); vecino de la proteína del gen 1 BRCA1 (NBR1; aumentado 12- veces); sequestosoma-1 (SQSTM1/p62; aumentado 5-veces); coactivador del receptor nuclear 4 (NCOA4; aumentado 3- veces); y LC3B (MAP1LC3B; aumentado 3- veces). La apolipoproteína B-100 (APOB; aumentada 66-veces) se derivó del suero fetal de ternera y no se estudió más a fondo. La inmunotransferencia confirmó que el tratamiento con DC661 o concentraciones más altas de HCQ produjo aumentos marcados en la expresión de los receptores de carga de autofagia NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 y NCOA4 de una manera dependiente de la dosis y el tiempo (Figura 1 complementaria, B y C). CRISPR/Cas9 KO de PPT1 en células A375P fenocopia los efectos de DC661 en estas proteínas en comparación con sus contrapartes WT (Figura 1D complementaria). Sin embargo, la expresión de los receptores de carga de autofagia y los aumentos relativos inducidos por el tratamiento con DC661 fueron variables entre el cáncer de colon, el cáncer de páncreas y otras líneas celulares de melanoma en las que DC661 demuestra citotoxicidad (Figura 1E complementaria). Esto sugirió que es poco probable que los propios receptores de carga de autofagia, aunque aumentados a nivel de proteína, sean responsables de la muerte celular después del tratamiento con DC661. Para confirmar esto, nos centramos en los receptores de carga de autofagia TAX1BP1 y BNIP3 porque tienen efectos proapoptóticos conocidos en las células cancerosas (Figura 1C). TAX1BP1 es un adaptador de carga de autofagia (11) y también regula la apoptosis inducida por inhibidores de la síntesis de proteínas o agentes que dañan el ADN en células cancerosas (12). La eliminación de TAX1BP1 por ARNip (Figura 1D) no afectó la citotoxicidad inducida por DC661-en ensayos de viabilidad a corto plazo (Figura 1E) y a largo plazo (Figura 1F). Estos resultados demostraron que TAX1BP1 no desempeña un papel esencial en la citotoxicidad mediada por DC661-. BNIP3 es una proteína proapoptótica que altera la bioenergética mitocondrial y regula la mitofagia (13). La eliminación efectiva de BNIP3 (Figura 1G) no afectó la citotoxicidad inducida por DC661-(Figuras 1, H e I). Estos resultados mostraron que los efectos citotóxicos de DC661 son independientes de la expresión de BNIP3. A continuación, estudiamos los efectos del agotamiento de las células de genes de autofagia canónica necesarios para la producción de autofagosomas sobre la eficacia de DC661 al derribar unc-51 como la quinasa activadora de autofagia 1 (ULK1) y el gen 7 relacionado con la autofagia (ATG7). La eliminación efectiva de ULK1 o ATG7 (Figura 2 suplementaria, A y B) inhibió el flujo autofágico (Figura 2C suplementaria) pero no afectó la citotoxicidad inducida por DC (Figura 1, J-M). Estos resultados mostraron que la ausencia de la maquinaria central esencial de autofagia no anula los efectos citotóxicos de DC661. La inhibición lisosomal por DC661 induce múltiples vías de muerte celular programada. El punto de vista canónico es que la muerte de las células lisosomales se debe a la apoptosis (5). La inmunotransferencia reveló que el tratamiento con DC661 resultó en la activación de caspasa-3, -7 y -9 y la escisión de PARP-1, lo que confirma que DC661 activó la apoptosis (Figura 2A). El inhibidor de pancaspasa Z-VAD-FMK impidió la activación de caspasa por DC661 pero no inhibió la acumulación de LC3B y p62, lo que demuestra que la activación de la apoptosis y el bloqueo de la autofagia son separables después de la inhibición lisosomal (Figura 2B). El bloqueo de la apoptosis con ZVAD-FMK no mejoró ni limitó la citotoxicidad de DC661, lo que sugiere que la apoptosis es prescindible para la muerte de las células lisosomales (Figura 2, C y D). Los efectos citotóxicos de DC661 fueron similares en células primarias de médula ósea Bax/Bak doble KO incapaces de sufrir apoptosis y células WT (Figura 2E). El bloqueo de la apoptosis tampoco afectó la citotoxicidad inducida por DC661-en el cáncer de colon y las células de cáncer de páncreas (Figura 2 complementaria, D – F). Debido a que encontramos que la apoptosis es prescindible para la muerte celular inducida por DC661-, investigamos si DC661 induce necroptosis, otra forma de muerte celular programada regulada por la proteína quinasa que interactúa con el receptor (RIPK) y una proteína similar al dominio de quinasa de linaje mixto ( MLKL). Los niveles de las formas fosforiladas y activadas de RIPK y MLKL aumentaron después del tratamiento con DC661 de 0,1 a 1 μM (Figura 2F). En DC661 3 μM hubo ausencia de RIPK1 fosforilado pero MLKL fosforilado persistente, lo que sugiere que, a esta concentración más alta, podrían participar formas adicionales de muerte celular. El tratamiento previo con los inhibidores de RIPK1 necrostatina-1 o necrostatina-1 o el inhibidor de MLKL necrosulfonamida impidió la fosforilación de RIPK1 después del tratamiento con DC661 (1 μM) en células de melanoma (Figura 2G), pero no logró rescatar a DC{{192 }}citotoxicidad inducida en células de melanoma (Figura 2H) o cáncer de colon o células de cáncer de páncreas (Figura 2G complementaria). Estos hallazgos sugieren que la necroptosis está activada pero es prescindible para la muerte celular mediada por DC661-.

Figura 1. La inhibición de la autofagia lisosomal induce cambios significativos en la apoptosis y las proteínas de la autofagia. (A)

Los lisosomas son uno de los principales sitios de almacenamiento de hierro. El metabolismo del hierro intracelular desregulado, junto con una capacidad reductora disminuida, puede desencadenar una muerte celular no apoptótica conocida como ferroptosis. Una característica distintiva de la ferroptosis es la regulación positiva de la prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (PTGS2), el homólogo 1 del regulador del transporte de cationes (CHAC1) y la cisteinil-ARNt sintetasa (CARS) (14). Los 3 marcadores de ferroptosis fueron regulados positivamente transcripcionalmente por el tratamiento con DC661 (Figura 3A), lo que sugiere que la inhibición lisosomal induce ferroptosis. DC661 indujo un cambio de fluorescencia en las células A375P tratadas con C11-BODIPY, lo que indica peroxidación lipídica, característica de la ferroptosis. Este cambio inducido por DC661- se revirtió significativamente en presencia de inhibidores de ferroptosis ferrostatina-1 o lip roxstatin-1 administrados a una concentración efectiva (Figura 3B y Figura 3A suplementaria), lo que indica además que DC661 ferroptosis inducida. Sin embargo, la inhibición de la ferroptosis no rescató la citotoxicidad asociada con DC661 (Figura 3, C y D). El cotratamiento de células cancerosas con el quelante de hierro deferoxamina (DFO) y DC661 no rescató la citotoxicidad de DC661 (Figura 3E). El tratamiento con ferrostatina -1, lip roxstatina -1 o DFO no rescató la inhibición de DC661 de la viabilidad a corto plazo o el crecimiento clonógeno a largo plazo en células de cáncer de melanoma, colon y páncreas (Figura complementaria 3, B –E, y Figura complementaria 4, A – D). Estos datos demuestran que la ferroptosis está activada pero es prescindible para la muerte celular mediada por DC661-. Una piroptosis es una forma de muerte celular programada asociada con una respuesta inflamatoria que implica la activación de caspasas que procesan gastrina (GSDM), lo que permite la formación de poros en la membrana plasmática y la posterior liberación de patrones moleculares asociados al daño, como la alta movilidad. cuadro de grupo 1 (HMGB1). El tratamiento con DC661 en múltiples líneas celulares de melanoma (A375P, A375, WM35 y WM793) dio como resultado la activación de las caspasas iniciadoras-8 y -9 y de las caspasas ejecutoras-7, típicas de la piroptosis, y produjo escisión de GSDME de longitud completa, similar en extensión al conocido inductor de piroptosis PLX4720 y PD0325901 (Figura 5A complementaria). DC661 produjo una liberación extracelular más fuerte de HMGB1 que el inductor de piroptosis conocido, BRAF y la inhibición de MEK en FBS al 1% (15), lo que refleja la consecuencia funcional de la piroptosis activada. A continuación, probamos si la inhibición de la piroptosis por GSDME KO mejoraría los efectos citotóxicos de DC661. El tratamiento con DC661 indujo la acumulación de LC3II y SQSTM1/p62 y la activación de caspasa, pero la liberación de HMGB1 fue anulada casi por completo en células humanas GSDME-KO WM35, lo que demuestra que se logró la consecuencia funcional de inhibir la piroptosis (Figura 3F). Sin embargo, el tratamiento con DC661 produjo una citotoxicidad igual en YUMM1.7 WT, vector vacío (EV) y células Gsdme KO1 y KO2 en condiciones de FBS al 10% y al 1% (Figura 3G y Figura complementaria 5B). Un resultado común de múltiples formas de muerte celular es la liberación de LDH. DC661 produjo un aumento significativo en la liberación de LDH, y esto no pudo revertirse mediante la inhibición de la apoptosis, la necroptosis o la ferroptosis (Figura 5C complementaria). Estos resultados mostraron que DC661 induce múltiples modos de muerte celular, incluidas la apoptosis y la piroptosis, así como la necroptosis y la ferroptosis, pero ninguno de estos modos de muerte celular es necesario para la muerte celular inducida por DC661-. La inhibición de la catepsina o la quelación del calcio no previenen la muerte celular por permeabilización de la membrana lisosomal. Habiendo demostrado que la activación de caspasa (que es necesaria para la apoptosis y la piroptosis) es prescindible para la muerte celular inducida por DC661-, planteamos la hipótesis de que la liberación de catepsina de los lisosomas podría causar la muerte celular dependiente de caspasa. La inhibición química (DC661) o genética (PPT1 siRNA [siPPT1]) de PPT1 produjo permeabilización de la membrana lisosomal (LMP), mientras que HDSF, un inhibidor irreversible menos potente de PPT1 que se agota rápidamente en el cultivo celular, no pudo inducir LMP, según se midió. por galectina-3–puntos positivos (Figura 4A). La LMP da como resultado la liberación de catepsinas y otros contenidos lisosómicos en el citoplasma y se cree que es una característica proximal clave de la muerte celular basada en lisosomas. La LMP inducida por DC661 se asoció con un aumento significativo en la actividad de catepsina-L citoplasmática, que se bloqueó significativamente con un inhibidor de cisteína proteasa E64 (Figura 4B). Informes anteriores han sugerido que la liberación de catepsina de los lisosomas fracturados promueve la activación de la caspasa, lo que lleva a la muerte celular apoptótica (16-18). La inhibición completa de la catepsina no previno la escisión de la caspasa (Figura 4C) y no rescató la citotoxicidad inducida por DC661-en ensayos de viabilidad a corto y largo plazo en melanoma (Figura 4, D y E), cáncer de colon y cáncer de páncreas. células cancerosas (Figura 6 complementaria, A – C). Estos resultados contradicen la visión canónica de que la muerte celular lisosomal es impulsada por la muerte celular mediada por catepsina. Además de la liberación de catepsina de los lisosomas con fugas, la liberación de calcio de los lisosomas se ha implicado en la disfunción celular cuando PPT1 está alterado (19). El tratamiento con DC661 produjo una liberación extensa de calcio, que fue anulada mediante un tratamiento previo con el quelante celular permanente de calcio (Ca2+), BAPTA-AM. (Figura 4F). En particular, BAPTA-AM no previno la LMP inducida por DC (Figura 4G) o la escisión de caspasa (Figuras suplementarias 6, D y E) y, lo más importante, no rescató la citotoxicidad inducida por DC ( Figura 4H). Estos hallazgos también se observaron en líneas celulares RKO y MIA PaCa-2, en las que no se observaron diferencias significativas en los valores de IC50 con BAPTA-AM y DC661 (Figura 6F complementaria), lo que sugirió que la muerte celular asociada a LMP es No depende del calcio ni de las catepsinas.

Figura 2. Apoptosis y necroptosis inducidas por DC661-. (A)

Figura 3. Ferroptosis y piroptosis inducidas por DC661-. (A)

LLP impulsa LMP. Habiendo establecido que los inhibidores de las principales vías de muerte celular (apoptosis, necroptosis, ferroptosis y piroptosis), las catepsinas (PepA y E64) y los quelantes de iones (BAPTA-AM [Ca2+] y DFO [Fe{{3} }]) no evitó la muerte celular por DC661 y al encontrar evidencia de peroxidación lipídica por C-11-BODIPY, realizamos un análisis global de lipidomas 2 y 4 horas después del tratamiento con DC661. DC661 indujo aumentos tempranos y sostenidos de 3- a 10-veces en cada clase de lisofosfolípido (Figura 5A). Por el contrario, se observaron cambios mínimos o nulos en las clases de fosfolípidos, incluidas la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol, el fosfatidilglicerol y el ácido fosfatídico (Figura 7A complementaria). Las especies de lisofosfolípidos pueden ser generadas por ROS, que oxidan la cadena de ácidos grasos saturados que luego es escindida por las fosfolipasas (20). Para determinar si los antioxidantes podrían prevenir el daño lipídico mediado por ROS, investigamos la citotoxicidad inducida por DC661-en presencia del eliminador pan-ROS N-acetilcisteína (NAC) (21, 22) y supuestos inhibidores de la peroxidación lipídica Trolox (23). ) y vitamina C (ácido ascórbico) (24, 25). A diferencia de cualquiera de los otros agentes probados hasta ahora, el tratamiento conjunto con NAC rescató la citotoxicidad asociada a DC661-en múltiples líneas celulares (Figura 5B y Figura 7B complementaria). Los ensayos de UFC a largo plazo mostraron que la NAC, a diferencia de todos los inhibidores de la muerte celular, quelantes de iones e inhibidores de catepsina probados en este documento, previno los efectos citotóxicos de DC661 en células A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 y MC38 ( Figura 5C y Figura complementaria 7C). Curiosamente, Trolox y la vitamina C no rescataron la citotoxicidad de DC661 en melanoma humano, cáncer colorrectal, células de cáncer de páncreas y melanoma murino y células de cáncer colorrectal (Figura 5D y Figura 7 complementaria, D – H). Esta disparidad nos llevó a probar si la NAC, Trolox y la vitamina C afectaban la FUM. Nuestros resultados mostraron que la NAC fue el único antioxidante que redujo significativamente la FUM inducida por DC661-(Figura 5E). Nuestra hipótesis es que la LLP impulsa la producción de LMP mediante DC661, que puede ser revertida por NAC pero no por Trolox y vitamina C. Para estudiar el proceso de LLP utilizamos la sonda fluorescente FOAM-LPO (26), que se localiza específicamente en el lisosoma y produce un cambio espectral de 586 a 512 nm (de rojo a verde) cuando se expone a peróxidos lipídicos. Encontramos que DC661 indujo LLP en comparación con el control (Figura 5F). La NAC redujo la peroxidación lipídica en los lisosomas de las células de melanoma tratadas con DC661-, mientras que Trolox y la vitamina C no lograron reducir la LLP (Figura 5F). La NAC, Trolox y la vitamina C por sí solas no tuvieron un efecto significativo sobre la peroxidación lipídica. La eliminación de PPT1 (Figura 8A suplementaria) o el tratamiento con altas concentraciones de HCQ (Figura 8B suplementaria) también indujo LMP que podría revertirse con NAC, mientras que la inhibición química de ULK1 no indujo LMP (Figura 8C suplementaria). Es importante destacar que la eliminación de siPPT1 también incluyó LLP que podría revertirse con NAC (Figura 8D complementaria). Estos resultados mostraron que la inhibición de PPT1 induce LLP que puede ser rescatada por NAC y es probablemente la causa de la LMP inducida por la inhibición de PPT1-. Además, estos hallazgos sugirieron que la LLP es fundamental para la muerte de las células lisosomales.

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La importación de cisteína a los lisosomas por MFSD12 atenúa la muerte celular lisosomal. De los 3 inhibidores de la peroxidación lipídica, sólo la NAC previno la LLP. Un informe reciente mostró que el dominio de la superfamilia facilitadora principal que contiene 12 (MFSD12) es un componente esencial del importador de cisteína para lisosomas y melanosomas (27). Razonamos que la NAC, o su metabolito cisteína, se transporta al lisosoma a través de MFSD12, donde la cisteína se oxida a su disulfuro, la cisteína. Para probar esta hipótesis, comparamos la capacidad de NAC para rescatar la citotoxicidad de DC661 en células siNT y siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Nuestros resultados mostraron que NAC rescató la LMP inducida por DC661- en células siNT pero no rescató la LMP en células siMFSD12 (Figura 6A). NAC redujo la LLP de las células siNT-A375P tratadas con DC661-, pero no de las células siMFSD12. Las células siMFSD12 tratadas con DMSO o NAC tuvieron un aumento de la LLP basal (Figura 6B) en comparación con las células siNT. Mientras que NAC rescató la citotoxicidad de DC661 en células siNT, la capacidad de NAC para rescatar la citotoxicidad de DC661 fue completamente anulada en células siMSFD12 (Figura 6C). Esto demostró que la eliminación de MFSD12 bloquea los efectos citoprotectores de NAC contra DC661. La NAC es desacetilada por la acilasa en el citosol (28). Para determinar si el tratamiento con NAC produce una acumulación de cisteína o cistina dentro de los lisosomas, empleamos la técnica de inmunoprecipitación lisosomal (Lyso-IP) (29) para purificar lisosomas de células A375P tratadas con DMSO y NAC (Figura 6D y Figura complementaria 9A) y realizamos Metabolómica dirigida para cuantificar NAC y metabolitos relacionados. Como se esperaba, se detectó NAC en el lisado de células enteras tratado con NAC y en las fracciones no unidas asociadas. Los niveles de L-cisteína aumentaron sustancialmente en los lisosomas tratados con NAC. La L-cistina solo fue detectable en los lisosomas tratados con NAC. Sorprendentemente, no encontramos un aumento significativo del glutatión (reducido) en los grupos tratados con NAC (Figura 6E); Esto fue sorprendente porque comúnmente se cree que el tratamiento con NAC induce una mayor producción de glutatión, corrigiendo el equilibrio redox. Estos resultados sugieren que la cisteína importada a los lisosomas a través del importador MFSD12 es fundamental para rescatar la LLP, la LMP y la muerte celular lisosomal. La LLP es inmunogénica. Algunas formas de muerte celular regulada inducida por DC661 (piroptosis, necroptosis, ferroptosis) se han identificado como inmunogénicas. Anteriormente, la muerte celular inmunogénica se describió para los fármacos de quimioterapia basándose en rasgos característicos, que incluyen la visualización de patrones moleculares asociados al daño, incluida la expresión de CALR en la superficie celular y la liberación de la proteína HMGB1 y el trifosfato de adenosina (ATP) (30). CALR actúa como una señal de "cómeme" cuando se expone a las superficies celulares durante el estrés celular. La liberación extracelular de HMGB1 y ATP actúa como una señal de "encuéntrame" reconocida por las células fagocíticas. Comparamos dos modelos: células B16F10, que en los modelos de tumores singénicos están casi completamente desprovistas de linfocitos infiltrantes de tumores, y células MC38, que en los modelos de tumores singénicos tienen linfocitos infiltrantes de tumores. Primero, demostramos que el tratamiento con DC661 o siPpt1 induce significativamente la expresión de CALR en la superficie que puede anularse por completo con el tratamiento conjunto con NAC en células MC38 (Figuras 7, A y B). Se observaron hallazgos similares en células B16F10 (Figura 7C). Los inhibidores de las principales vías de muerte celular (apoptosis, necroptosis, ferroptosis y piroptosis) no lograron prevenir la expresión superficial de CALR (Figura 7D). Para determinar si la muerte celular inmunogénica inducida por DC661 se debe a la regulación positiva del MHC de clase I, se trataron células B16F10 y MC38 con DC661 (3 μM) o DMSO durante 24 horas. Descubrimos que el tratamiento con DC661 no aumentó la expresión del MHC de clase I ni la regulación positiva del inmunoproteasoma (Figura 7E y Figura 9 complementaria, B y C).

Figura 4. La inhibición de la catepsina o la quelación del calcio no previenen la muerte celular inducida por DC661-. (A)

Para comprender los efectos de la inhibición de la autofagia en el cebado de células T, realizamos un experimento de cebado y cocultivo in vitro utilizando esplenocitos C57BL6/J como se describió anteriormente (31). Para el cebado, expusimos los esplenocitos a células DC661- o B16F10 o MC38 tratadas con DMSO. A continuación, estos esplenocitos preparados se cultivaron con células B16F10 o MC38 vivas y se midió la citotoxicidad (Figura 8A). Los esplenocitos preparados con células B16F10 tratadas con DC661- produjeron un aumento significativo de IFN- en comparación con los esplenocitos expuestos a células B16F10 tratadas con DMSO. La destrucción de células B16F10 en proliferación mediada por células T preparadas aumentó significativamente en los esplenocitos preparados con DC661-en comparación con los esplenocitos preparados con DMSO (Figura 8, B y C). Las células MC38 tratadas con DC661 produjeron aún más IFN y citotoxicidad de células T preparadas en comparación con las células B16F10 (Figura 8, D y E). El cotratamiento de NAC con DC661 pudo anular completamente la liberación de IFN de los esplenocitos y atenuar la citotoxicidad de las células T preparadas (Figura 8, F y G). La eliminación de calreticulina por siCalr en células MC38 (Figura 9D complementaria) anuló la eficacia de preparación del tratamiento con DC661 y redujo significativamente la citotoxicidad de las células T preparadas (Figura 8, H e I). En conjunto, estos datos respaldan un papel mecanicista de la regulación positiva de CALR asociada a LLP en la promoción de la inmunidad de las células T antitumorales. A continuación, ampliamos estos hallazgos in vitro a un estudio de vacunación antitumoral in vivo en modelos de ratones inmunocompetentes e inmunodeficientes. Para este ensayo, se inyectaron células B16F10 o MC38 in vitro descongeladas o tratadas con DC661- sc en el flanco izquierdo para proteger a ratones inmunocompetentes C57BL/6 o NOD/SCID contra la nueva exposición a células tumorales vivas del mismo tipo inyectado. 7 días después en el flanco derecho (Figura 9A). Las células B16F10 tratadas con DC661- no lograron prevenir el rechazo del tumor a pesar de los ensayos in vitro, lo que sugiere que DC661 indujo la muerte celular inmunogénica (Figura 9B y Figura complementaria 9E). Por el contrario, la inoculación de un flanco con células MC38 tratadas con DC661- promovió el rechazo completo de las células MC38 vivas implantadas en el flanco opuesto (Figura 9C y Figura complementaria 9F). Para determinar si la inmunidad adaptativa era fundamental para el efecto de la vacuna DC661 que parecía tener con los tumores MC38, repetimos el experimento en ratones NOD/SCID. Sorprendentemente, encontramos que las células MC38 tratadas con DC661- no indujeron el rechazo de los tumores sometidos a reexposición en ratones NOD/SCID inmunodeficientes (Figura 9D y Figura 9G suplementaria), lo que indica que se requería inmunidad adaptativa para el efecto observado de la vacuna. Para probar la solidez de este hallazgo, seleccionamos otra línea celular de cáncer de ratón inmunogénico bien conocida, CT26, y realizamos el experimento de vacunación como se indicó anteriormente. Como se esperaba, la implantación de células CT26 tratadas con DC661- en un flanco del ratón produjo un efecto similar a la vacuna y evitó el crecimiento de células CT26 vivas implantadas en el otro flanco (Figura 9E y Figura complementaria 9H). Nuestros hallazgos sugirieron que la LLP inducida por DC661- es fundamental para la muerte celular inmunogénica mediada por LMP, que se revierte mediante la importación de cisteína al lisosoma mediante el transportador lisosomal MFSD12 (Figura 9F).

Discusión

La inhibición lisosomal parece ser un enfoque terapéutico prometedor en estudios preclínicos, y los ensayos clínicos de HCQ han producido resultados alentadores pero mixtos (1, 32). PPT1 es el objetivo molecular de la HCQ, y los inhibidores de PPT1 más potentes, como DC661 (2) y GNS561 (3), inducen la muerte celular mediada por LMP in vitro. El mecanismo preciso de la muerte de las células lisosomales y su papel en la inmunogenicidad del tumor no se ha dilucidado por completo. La inmunidad antitumoral mejora cuando la inhibición de la autofagia se combina con inmunoterapia (9, 10, 31). Los mecanismos propuestos para la inmunogenicidad intrínseca de las células después de la inhibición de la autofagia incluyen el MHC de clase I y la regulación positiva del inmunoproteasoma, que respaldan un mejor procesamiento y presentación de antígenos. Además, la pérdida de proteínas de autofagia o la inhibición de la autofagia por la cloroquina aumentó la respuesta de las células T CD8+ al aumentar los niveles superficiales de MHC clase I en las células dendríticas (33). Anteriormente demostramos que la inhibición sistémica de PPT1 puede repolarizar los macrófagos de un fenotipo M2 a M1. Los inhibidores de PPT1 pueden aumentar los niveles de STING, lo que lleva a la liberación de IFN y al aumento de la muerte mediada por células T en modelos de melanoma (31). Aquí, demostramos que la LLP en sí misma produce una forma inmunogénica de muerte celular intrínseca de las células tumorales. Descubrimos que la inhibición lisosomal inducía muy pocos cambios proteicos en las células cancerosas, y las proteínas más elevadas incluían receptores de carga de autofagia y reguladores de apoptosis. Nuestro enfoque dirigido a algunos de estos genes en todas las funciones demostró que las proteínas inducidas por fármacos probablemente no eran los principales reguladores de la muerte celular. La inhibición genética de ULK1 o ATG7 tampoco rescató la citotoxicidad de DC661. Demostramos que la inhibición lisosomal activa múltiples formas de muerte celular programada, incluidas la apoptosis, la necroptosis, la ferroptosis y la piroptosis, pero cada una de ellas era prescindible para la citotoxicidad inducida por fármacos. Es de destacar que los mecanismos de muerte celular programada pueden superponerse y la codirección de múltiples mecanismos de muerte celular podría proporcionar citoprotección contra la muerte celular después de la permeabilización de la membrana lisosomal. Nuestro trabajo ha descartado los mecanismos dependientes de catepsina y calcio para la muerte celular lisosomal y ha resaltado la importancia de la LLP como determinante crítico de la muerte celular. Encontramos evidencia de LLP que era reversible mediante un antioxidante que se transportaba al lisosoma, NAC, y era fundamental para la permeabilización y citotoxicidad de la membrana lisosomal. La NAC fue el único agente capaz de mitigar o revertir la muerte celular inducida por DC661-, y esta capacidad dependía de la presencia del transportador lisosomal de cisteína MFSD12. Es probable que la falta de penetración lisosomal sea la razón por la que otros supuestos inhibidores de la peroxidación lipídica, Trolox y la vitamina C, no pudieron prevenir la citotoxicidad del DC661. La NAC se convierte en cisteína, que se importa a los lisosomas y se oxida a su forma disulfuro, cistina. La cistina se exporta al citosol mediante otro transportador lisosomal, la cistinosis, donde se reduce a cisteína que removiliza las fuentes internas de nutrientes, reactiva el objetivo del complejo 1 de rapamicina y promueve la autofagia (34). Este ciclo de oxidación-reducción de cisteína a cistina (lisosomas) y nuevamente a cisteína (citosol) podría ser un posible mecanismo de rescate de la NAC contra la citotoxicidad del DC661 o una lesión lisosomal más general en otros contextos de enfermedades donde la NAC ha demostrado ser útil terapéuticamente (35). . NAC no solo revirtió la LLP y LMP inducidas por DC661-, sino también la expresión superficial del marcador inmunogénico de muerte celular calreticulina. La expresión de la proteína CALR en la superficie celular fue necesaria para la citotoxicidad mejorada mediada por células T inducida por esplenocitos preparados con DC661-, lo que demuestra que la inhibición lisosomal produce una forma específica de inmunogenicidad intrínseca a las células.

Si bien estudios previos han demostrado que la inhibición lisosomal puede mejorar la actividad antitumoral de la inhibición del punto de control inmunológico en tumores de flanco establecidos (9, 31), nuestro estudio es el primero hasta donde sabemos en demostrar un efecto similar a una vacuna para los tumores MC38 pero no para los tumores B16 en células tumorales pretratadas con DC661 antes de la implantación. Esto demuestra que la muerte de las células lisosomales puede inducir inmunogenicidad celular intrínseca, pero estos cambios por sí solos no son suficientes para revertir un microambiente tumoral "inmune frío" en un microambiente tumoral "inmune caliente". Nuestros estudios previos en modelos de microambiente tumoral B16 de "frío inmune" y modelos de ratón modificados genéticamente BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 (31) demostraron que la inhibición lisosomal sistémica producía efectos en los macrófagos asociados a tumores y en las células supresoras derivadas de células mieloides que eran suficientes para mejorar la eficacia de la inmunoterapia. Puede darse el caso de que la inmunogenicidad celular intrínseca también desempeñe un papel en estos tumores inmunes fríos que se vuelven más sensibles al ICD después de la inhibición lisosomal. El efecto similar a una vacuna de la inhibición lisosomal observado en un ambiente de laboratorio controlado puede o no traducirse en la clínica, pero podría explicar por qué algunos pacientes tratados con dabrafenib, trametinib y HCQ en melanoma mutante BRAF previamente tratado tuvieron una respuesta tan profunda y duradera. respuesta a este régimen (32). Se necesitan más estudios para comprender cómo la inhibición de PPT1 produce ROS lisosomales y peroxidación lipídica. La regulación dependiente de PPT1- de la V-ATPasa y la acidificación lisosomal no es una explicación suficiente porque la bafilomicina inhibe la acidificación lisosomal pero no produce FUM (datos no mostrados). Las implicaciones de estos hallazgos sugieren que los inhibidores lisosomales que mejoran la inmunogenicidad intrínseca de las células tumorales se pueden combinar racionalmente con terapias que mejoran la activación de las células T o la infiltración en el microambiente del tumor, lo que potencialmente produce efectos sinérgicos.

Figura 5. La N-acetilcisteína previene la muerte celular inducida por DC661-. (A)

Métodos

Cultivo de células. Humano A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), las líneas celulares A549 (CRM-CCL-185) y de ratón B16F10 (CRL-6475) se adquirieron de ATCC. Las líneas humana A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 y YUMM1.7 de ratón (WT, Gsdme EV y Gsdme KO1 y KO2) se obtuvieron internamente. Andy Minn, de la Universidad de Pensilvania, proporcionó las células MC38 y CT26 de ratón. Las células primarias de médula ósea Bax-/-Bak-/- (Bax/Bak DKO) dependientes de FL5.12 e IL-3 se obtuvieron de Kathryn E. Wellen, Universidad de Pensilvania. La línea celular humana Panc-1 (CRL-1469, ATCC) fue proporcionada por Ben Z. Stanger, de la Universidad de Pensilvania. La línea celular de ratón YUMMER 1.7 se obtuvo de Xiaowei (George) Xu, Universidad de Pensilvania. Todas las líneas celulares fueron analizadas dos veces al año para detectar Mycoplasma en las instalaciones centrales de la Universidad de Pensilvania y el núcleo de Genómica del Instituto Wistar las autenticó mediante tomas de huellas dactilares repetidas en tándem corto. Las líneas celulares A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 y Bax/Bak DKO se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Las líneas celulares A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 y MC38 se cultivaron en DMEM (Invitrogen, 11995); y se cultivaron células YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV y Gsdme KO1 y KO2 (15) en DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Los medios de cultivo se complementaron con suero bovino fetal al 10 % (12306C, MilliporeSigma) y solución antimicótica antibiótica 1X (Gibco, 15140-122). Las líneas celulares FL5.12 y Bax/Bak DKO se mantuvieron en medio RPMI completo suplementado con -mercaptoetanol 50 μM (Life Technologies, 21985-023), HEPES 10 mM (H3537, MilliporeSigma) y 0,35 ng/mL y 3,5 ng. /mL IL-3, respectivamente. Las líneas celulares YUMMER1.7 y YUMM1.7 (WT, Gsdme EV y Gsdme KO) se mantuvieron en medios completos complementados con 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Las células WM35 y WM793 se cultivaron en medio MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), que contenía FBS al 10% en medio Leibovitz L-15 1x (Corning, 10-045-CV), bicarbonato de sodio al 7,5% p/v ( Corning, 25-035-CI), solución antimicótica antibiótica 1X (Gibco, 15140-122) y 5 ug/ml de insulina (MilliporeSigma, I0516). Las células se cultivaron a 37 grados en presencia de 5% de CO2. Sustancias químicas y reactivos. Los productos químicos comprados incluyeron sulfato HCQ (Spectrum Chemicals, 747-36-4) y DC661 (Selleckchem, S8808). Se utilizó Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) para teñir las células en busca de calcio según las instrucciones del fabricante. En la Tabla complementaria 1 y en la Tabla complementaria 2 se proporciona una lista de anticuerpos e inhibidores.

Figura 6. NAC invierte la LLP de manera dependiente de MFSD12-. (C.A)

Extracción y digestión de proteínas para cromatografía líquida-análisis de espectrometría de masas en tándem para proteómica. {{0}}.7 × 106 células de melanoma A375P se cultivaron en placas de cultivo de 60 mm. Las células se trataron con DMSO (control), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) o HCQ (3{{70}} μM) durante 24 horas a aproximadamente 5{{ 112}}% de confluencia. Los sedimentos celulares congelados se lisaron con Tris 50 mM, pH 7,4, SDS al 1 %, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0.PMSF 15 mM, pepstatina 1 ug/ml, y 1 ug/ml de leupeptina. Los lisados ​​clarificados (10 ug cada uno) se sometieron a electroforesis de 0,5 cm en un gel de bis-tris seguido de fijación y tinción con Coomassie coloidal. Cada carril de gel de 0,5 cm se cortó, se tiñó, se redujo con tris (2-carboxietil)fosfina, se alquiló con yodoacetamida y se digirió con tripsina como se describió anteriormente (36). Los digestos (1 ug) se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) en línea con un nanoAQUITY UPLC (Waters). La separación analítica se realizó en una columna Peptide BEH C18 de 1,7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) usando un gradiente 245-minuto con ácido fórmico al 0,1 % en agua (fase móvil A) y acetonitrilo (fase móvil B) de la siguiente manera : 5%–30% B durante 225 minutos, 30%–80% B durante 5 minutos, 15-mantener durante un minuto al 80% B y volver a las condiciones iniciales. Los espectros de MS completos se adquirieron con una resolución de 70,{49}}, con un rango de escaneo de 400–2,000 m/z, un objetivo de control de ganancia automático de 3 × 106 iones y un tiempo máximo de inyección de 50 milisegundos. Se adquirieron espectros MS2 dependientes de los datos para los 20 iones más abundantes con una resolución de 17.500, con un ancho de aislamiento de 1,5 m/z, un objetivo de control automático de ganancia de 5 × 104 iones y un tiempo máximo de inyección de 50 milisegundos. La coincidencia de péptidos se configuró como preferida y se rechazaron los iones no asignados y con carga única (37). Los datos sin procesar de MS se analizaron utilizando MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) con una base de datos de secuencia humana Uniprot (consultada el 10 de octubre de 2019) y una base de datos de contaminantes comunes, que incluyen tripsina, queratinas, proteínas bovinas, y micoplasma (38). En la búsqueda se utilizó especificidad del péptido tríptico con un máximo de 2 escisiones perdidas, modificación fija en cisteína (carbamidometilación) y oxidación de metionina variable o acetilación N-terminal (39). Se utilizó un límite del 1% de FDR para péptidos y proteínas. Se habilitó el emparejamiento entre carreras; Las proteínas se cuantificaron mediante cuantificación sin etiquetas (40). El análisis estadístico se realizó utilizando Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Las proteínas debían identificarse mediante al menos 3 péptidos únicos y tener 3 valores válidos (cuantificación distinta de cero) dentro de un grupo de muestra, y los contaminantes y las proteínas inversas se filtraron del conjunto de datos. Los valores faltantes se imputaron a partir de una distribución normal. Se realizaron comparaciones por pares entre condiciones a nivel de proteína utilizando una prueba t de Student 2-de cola con FDR basada en permutaciones con s0=0.1 y 250 aleatorizaciones. Los cambios significativos se definieron como una FDR inferior al 5% y un cambio absoluto superior a 1,5 o 2,0, según se especifica. Lyso-IP. Las células A375P se infectaron con lentivirus pLJC5-Tmem192-3xHA y se seleccionaron usando 1 mg/ml de puromicina (MilliporeSigma, P4512). Aproximadamente 3 x 106 células A375P marcadas con HA se trataron con NAC 10 mM o control de vehículo acuático durante 24 horas en las condiciones de cultivo descritas anteriormente. Después del tratamiento, las células se lavaron en PBS, se recogieron en 0,5 ml de KPBS frío y se homogeneizaron suavemente utilizando 20 pasadas en un homogeneizador Dounce de 2 ml. Aproximadamente el 2,5 % del homogeneizado se reservó para el análisis del lisado de células completas y el resto se centrifugó a 3 g durante 2 minutos a 4 grados para eliminar los restos de la membrana celular. Luego se transfirió el sobrenadante homogeneizado a un tubo limpio de 1,5 ml y se incubó con 50 µl de perlas anti-HA (Pierce, 88836) o perlas anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) durante 15 minutos a 4 grados. Luego se precipitaron las muestras colocando tubos en DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) y se agitaron suavemente durante 2 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se reservó para el análisis de la fracción libre. El IP se lavó 3 veces con KPBS que contenía CaCl2 8 mM. El Lyso-IP se extrajo en MeOH al 80% para análisis metabolómico. Extracción y análisis de lípidos mediante LC-MS/MS para lipidoma global. Se sembraron células de melanoma A375P en placas de 60 mm a 0,7 x 106 células por placa. Cuando las células tenían aproximadamente un 50% de confluencia, se trataron con DMSO (control), DC661 (3 μM) o HCQ (30 μM) durante 24 horas. Las células se lavaron 2 veces con HBSS, se rasparon en metanol helado y se transfirieron a tubos de vidrio para extracción de lípidos con cloroformo/metanol/NaCl al 0,88 % (2:1:1) que contenía un estándar lipídico interno EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Las muestras se agitaron y luego se sonicaron en baño de agua durante 5 minutos en hielo. Después de centrifugar a 500 g durante 15 minutos a 40 grados, la fase inferior se transfirió a otro tubo de vidrio. La fase superior se volvió a extraer utilizando una fase inferior sintética. Después de la sonicación y centrifugación, la fase inferior se combinó con la primera colección de fase inferior. Las muestras se secaron bajo nitrógeno, se resuspendieron en cloroformo al 10 %/metanol al 90 % y se transfirieron a viales de vidrio LTQ. Las muestras de lípidos se analizaron en un espectrómetro de masas Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X y un sistema Vanquish Horizon UHPLC. La separación analítica utilizó una columna Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) con acetonitrilo/agua 50:50 y isopropanol/acetonitrilo/agua 88:10:2, cada uno de los cuales contenía formiato de amonio 5 mM y ácido fórmico al 0,1 %. Los datos LC-MS/MS se adquirieron por separado en polaridades positiva y negativa con los siguientes parámetros del instrumento: escaneo MS1 120, resolución 000; MS2 dependiente de datos sobre los 20 iones más abundantes con una resolución de 15,000; ancho de aislamiento de 0,4 m/z; y una energía de colisión normalizada escalonada de 20:30:40 (43).

Figura 7. La N-acetilcisteína previene la expresión superficial de calreticulina inducida por DC661-. (ANUNCIO)

Los lípidos se identificaron y cuantificaron utilizando LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Las especies de lípidos identificadas se filtraron según los aductos esperados y el grado de identificación según la clase. Las áreas de pico se normalizaron según los estándares EquiSPLASH para las clases admitidas y se normalizaron aún más en función del área total de cada muestra para corregir la variación en el número de celdas. El análisis estadístico se realizó con datos transformados logarítmicamente utilizando Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Extracción y análisis de metabolitos mediante LC-MS/MS para metabalón. Los metabolitos polares se extrajeron de células enteras, fracciones no unidas de Lyso-IP y muestras unidas a Lyso-IP utilizando metanol al 80% y se almacenaron a –8{{30}} grados antes de la cromatografía líquida. –análisis por espectrometría de masas (LC-MS). Los extractos se analizaron mediante LC-MS utilizando un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q-Exactive HF-X con una sonda HESI II en línea con un sistema Thermo Vanquish Horizon UHPLC. La separación por LC se realizó utilizando una columna ZIC-HILIC (2,1 mm x 150 mm, tamaño de partícula de 5 μm, EMD Millipore) con una columna protectora ZIC-HILIC (2,1 mm x 20 mm, EMD Millipore) mantenida a 45 grados con un caudal de 0,2 ml/min. La cromatografía se realizó en condiciones ácidas para reducir la reactividad de los grupos tiol. La fase móvil A era agua y B era acetonitrilo, conteniendo ambas ácido fórmico al 0,1%. El gradiente de LC fue del 85 % de B durante 2 minutos, del 85 % de B al 20 % de B durante 15 minutos, del 20 % de B al 85 % de B durante 0,1 minutos y del 85 % de B durante 8,9 minutos. El muestreador automático se mantuvo a 4 grados y se inyectaron 4 μl de cada muestra por análisis. Se utilizaron los siguientes parámetros de MS: caudal de gas envolvente, 40 AU; caudal de gas auxiliar, 10 AU; caudal de gas de barrido, 2 AU; temperatura del calentador de gas auxiliar, 350 grados; tensión de pulverización, 3,75 kV para modo positivo y 3,5 kV para modo negativo; temperatura capilar, 375 grados; y nivel de RF del embudo, 40%. Todas las muestras se analizaron mediante MS completa con cambio de polaridad. Se adquirieron escaneos MS completos de 65 a 975 m/z con una resolución de 120{59}} con un objetivo de control de ganancia automático de 1 × 106 iones y un tiempo de inyección máximo de 100 milisegundos. Los datos sin procesar se analizaron utilizando TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Los metabolitos objetivo se identificaron mediante masa precisa y tiempo de retención en su polaridad preferida según estándares analíticos. La detección de picos utilizó el algoritmo ICIS con un suavizado de 1. La cuantificación relativa se realizó utilizando un área de pico integrada y estos valores se corrigieron a la cantidad total por muestra (definida como el área de pico total). PPT1-Edición CRISPR/Cas9. Se prepararon células KO y no objetivo A375P PPT1- como se describió anteriormente (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) fue un regalo de Feng Zhang (plásmido Addgene, 48139). Los oligos de ARN guía (IDT) se reasociaron, fosforilaron y luego ligaron en el plásmido pX459 digerido y desfosforilado con BbsI siguiendo los protocolos del laboratorio de Zhang, disponibles a través de Addgene. Los plásmidos ligados se transformaron en células Stbl3 (Invitrogen). La secuenciación de las preparaciones de plásmidos confirmó la presencia de las secuencias de ARN guía deseadas. Las células A375P se transfectaron usando Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), seguido de selección con puromicina. Los ensayos de Surveyor confirmaron la edición del gen PPT1 mediante CRISPR/Cas9, y la eliminación de PPT1 se confirmó mediante transferencia Western con anticuerpo PPT1 (Origene). Las secuencias de oligos de ARN guía son las siguientes: ARN guía no objetivo directo (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), ARN guía no objetivo inverso (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ARN guía PPT1 humano 1 directo (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), ARN guía PPT1 humano 1 inverso (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), ARN guía PPT1 humano 3 hacia adelante (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) y el ARN 3 guía PPT1 humano hacia atrás (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Los clones cultivados a partir de células individuales utilizados en este artículo incluyen los siguientes: el clon C8 es la guía humana 1 y el clon B5 es la guía humana 3. Inmunotransferencia. Se sembraron un millón de células en una placa de 10 cm y se administraron los tratamientos al día siguiente; Las células se recogieron mediante raspado. Los lisados ​​de células enteras se prepararon utilizando tampón de lisis SDS. La concentración de proteína se midió utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Se utilizaron 30–50 ug de proteína para SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad, 1620177). La membrana se bloqueó con BSA al 5% o leche desnatada al 5%, según las condiciones optimizadas, y se incubó con anticuerpo primario durante la noche a 4 grados. Las membranas de PVDF se lavaron con 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario conjugado con HRP específico de la especie. Posteriormente, las membranas se lavaron y revelaron utilizando sustrato de transferencia Western Pierce ECL (Thermo Fisher Scientific, 32106) y películas de autorradiografía (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Para los estudios de piroptosis, los lisados ​​de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear en BSA al 5%, las membranas de PVDF se incubaron con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 grados, se lavaron en PBS/Tween y se incubaron con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa. La inmunorreactividad se detectó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP (CalBioTech), un sustrato de quimioluminiscencia (Thermo Fisher Scientific) y un sistema de imágenes ChemicDoc MP (Bio-Rad). Para los experimentos con sobrenadante, las células se cultivaron en un medio libre de FBS para evitar la distorsión de SDS-PAGE. Los sobrenadantes celulares se recogieron y se centrifugaron durante 10 minutos a 500 g a 4 grados para eliminar los restos celulares. Los sobrenadantes resultantes se concentraron 10 veces usando Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) mediante centrifugación durante 30 minutos a 4.500 g a 4 grados. Los concentrados se mezclaron con tampón de muestra y se analizaron mediante transferencia Western como se describe anteriormente. La tinción del gel de proteínas se realizó utilizando tinción con rojo Ponceau. Ensayo de actividad de LMP y catepsina L. El plásmido humano pEGFP-hGal3 fue un regalo de Tamotsu Yoshimori (plásmido Addgene, 73080) y se utilizó para crear la línea A375P-Galectin-3. Se adquirió la estructura principal del vector del plásmido de control pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Los plásmidos se transfectaron (1 ug/ml) en células A375P utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) según el protocolo del fabricante; Las células transfectadas se seleccionaron de forma estable utilizando G418 (Gibco, 10131035). Para LMP, se contaron un total de 25 células puncta positivas para A375P-galectina-3 en múltiples campos de imagen. El porcentaje de células puncta positivas se calculó en cada campo por separado y se calculó un porcentaje promedio para cada grupo. Se utilizó el kit de ensayo Magic Red Catepsin L (Abcam, ab270774) según el protocolo del fabricante. Se tomaron imágenes de las células bajo un microscopio invertido Zeiss Axio Observer 7. La intensidad integrada bruta de Magic Red se calculó utilizando el software Fiji - ImageJ (NIH). Ensayo de viabilidad celular de MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il]-2, bromuro de 5 difenil tetrazolio). Se sembraron 2000 células por triplicado en cada pocillo de una placa de 96-pocillos y se realizaron ensayos de MTT de 3- días utilizando el kit de viabilidad celular (Roche, 11465007001) según el protocolo del fabricante. Se administró un pretratamiento con inhibidor durante 1 hora, seguido de un cotratamiento de las células con inhibidores con o sin DC661. Se utilizó el método de regresión no lineal (ajuste de curvas) para calcular la CI50.

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Ensayo de formación de colonias. Se sembraron 2,000 células por pocillo en una placa de 6-pocillos y se trataron al día siguiente; Las células se mantuvieron bajo tratamiento durante un total de 8 días. Las colonias formadas en cada pocillo se lavaron con PBS, se fijaron con metanol frío a –20 grados durante 20 minutos y se tiñeron con una solución acuosa de cristal violeta al 0,5 % (V5265; MilliporeSigma).

Ensayo de exclusión del colorante azul tripán. La mezcla de reacción para el ensayo de azul tripán se preparó mezclando 1 parte de 0.4 % de azul tripán (25- 900-CI, Corning) y 1 parte de muestras de células diluidas. La mezcla se incubó durante 1 minuto y las células se contaron en Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Figura 8. La expresión superficial de calreticulina inducida por DC661- prepara las células T contra las células tumorales. (A)

Figura 9. La inoculación de células tratadas con DC661- produce rechazo tumoral en contextos específicos. (A)

ESPUMA-LPO. La LLP se estudió utilizando una sonda fluorescente, FOAMLPO. FOAM-LPO se sintetizó como se describió anteriormente (26). Las células se cultivaron en un portaobjetos de 8 pocillos (ibid, 80807) y se trataron con inhibidores y con o sin DC661. Las células se incubaron con medio que contenía FOAM-LPO (1 M) en una atmósfera de 5% de CO2 y 95% de aire durante 5 minutos a 37 grados. Las células se lavaron dos veces con medio y luego se observaron las células bajo el microscopio (microscopio invertido Zeiss Axio Observer 7) para detectar el cambio de fluorescencia de 586 a 512 nm en respuesta a LLP. qRT-PCR y cebadores. Se cultivaron células A375P (3 x 105) en placas de 60 mm y se trataron con DMSO o DC661 (3 μM) durante 24 horas. El ARN total se aisló con un kit de aislamiento de ARN (QIAGEN, 74134) según el protocolo del fabricante. El ADNc se sintetizó utilizando un kit de transcriptasa inversa iScript con 500 ng de ARN purificado según el protocolo del fabricante (Thermo Scientific, K1642). La reacción de qPCR se configuró utilizando SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) que contenía 1 μL de ADNc. Todas las mediciones se realizaron por triplicado y se utilizó BACTIN como estándar interno para los cálculos de ΔCT. El análisis de la expresión génica se realizó utilizando los siguientes cebadores: PTGS2/COX-2 adelante (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 atrás (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS adelante (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS atrás (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 adelante (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 inverso (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN adelante (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) y BACTIN inverso (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

Transfección de ARNip. Se realizaron estudios de eliminación genética de ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 y MFSD12 humanos en líneas celulares A375P. Los estudios de inhibición genética para Ppt1 y calreticulina de ratón se realizaron en células MC38. ARNip no objetivo (sc{{10}}), ULK1 humano (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), Ppt1/Cln1 de ratón (sc-142398) y calreticulina Los ARNip de /Calregulin (sc-29895) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Estos ARNip constan de grupos de 3 a 5 ARNip específicos del objetivo. Citometría de flujo. La inducción de ferroptosis se midió utilizando C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Se sembraron células A375P en una 6-placa de pocillos y se trataron con DMSO, ferrostatina{{40}} (10 μM), lip roxstatin-1 (2 μM), elastina (5 μM). ), DC661 (3 μM) o una combinación durante 24 horas. Las células se recogieron mediante centrifugación a 300 g durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en 500 µl de 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) que contenía C11-BODIPY 1 µM y se incubaron a 37 grados durante 15 minutos. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 500 μl de 1X HBSS y la intensidad de la fluorescencia se midió en un citómetro BD LSRII usando 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). La cuantificación de la expresión de calreticulina en la superficie celular para la muerte celular inmunogénica se realizó como se describió anteriormente (45) mediante citometría de flujo. Se cultivaron células B16F10 o MC38 y se trataron con NAC (10 mM) o DC661 (3 μM) durante 24 horas. Las células MC38 se trataron con siPpt1 o siNT durante 48 horas en presencia o ausencia de NAC 10 mM durante 24 horas. Las células se tiñeron con anticuerpo CALR (Cell Signaling Technology, 12238), segundo anticuerpo anti-conejo de cabra Alexa Fluor 647 (Invitrogen) y yoduro de propidio (PI) (Biolegend, 421301). Las muestras teñidas se adquirieron en un citómetro de flujo BD LSRII usando 710/50 Blue y 670/30 Red para capturar la fluorescencia de PI y CALR, respectivamente (instalaciones Flow Core de la Universidad de Pensilvania), y el análisis se limitó a células CALR positivas y PI negativas. para evitar eventos falsos positivos. Cebado de células T y porcentaje de citotoxicidad. Se cultivaron células tumorales B16 o MC38 (5 x 104) y se trataron con NAC (10 mM) o DC661 (1 μM o 3 μM), respectivamente, durante 24 horas. Para la inhibición genética de Calr, las células MC38 se trataron con ARNip de Calr o ARNip no objetivo (NTsi) durante 48 horas, seguido de tratamiento con DMSO o DC661 3 μM durante 24 horas. Luego, los esplenocitos se cultivaron con DC661 con o sin células B16 o MC38 en presencia de IL-2 (5 UI/ml) y se cocultivaron durante 72 horas. El cebado se confirmó mediante IFN-ELISA (Biolegend, 430815) del sobrenadante. Luego, los esplenocitos cebados se cultivaron conjuntamente con células B16 o MC38 recién cultivadas con proporciones de objetivo a efector (B16 o MC38 a esplenocitos) de 1:20 y 1:50 para las células B16 y MC38, respectivamente. La liberación de LDH asociada a la muerte de las células B16 o MC38 y luego el porcentaje de citotoxicidad se midieron de acuerdo con el protocolo del fabricante (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Ensayos de vacunación antitumoral y estudios de quimioterapia con modelos de cáncer establecidos. Se obtuvieron ratones hembra WT C57BL/6, NOD/SCID y BALB/c de seis a ocho semanas de edad del Laboratorio Jackson. Para experimentos de vacunación antitumoral, se trataron células WT B16F10, MC38 y CT26 con DC661 (3 μM) durante 36 horas en matraces de 175 cm2. Luego, se recogieron los sobrenadantes y las células desprendidas en un tubo Falcon de 50 ml. Las células se centrifugaron y se lavaron con PBS enfriado con hielo. Para la vacunación, se inyectaron sc 150 μl de suspensión celular en el flanco izquierdo de ratones C57BL/6 inmunocompetentes, ratones NOD/SCID inmunodeficientes (1,8 × 104 células B16F10, 1,5 × 106 células MC38 por ratón) o ratones BALB/c singénicos (3,0 × 106 células CT26 por ratón). Se inyectaron células descongeladas por congelación resuspendidas en PBS como control negativo. Una semana después, se inyectaron células cancerosas vivas del mismo tipo (3 × 104 células B16F10, 2 × 105 células MC38 o 5 × 105 células CT26 por ratón) con un volumen igual de Matrigel (Corning, 354248) en el flanco derecho. de ratones vacunados. Los tumores se midieron utilizando calibradores electrónicos y el volumen se calculó como L × W2 × 0,5. El crecimiento del tumor se controló periódicamente durante los días siguientes y la ausencia de tumores se consideró una indicación de una vacunación antitumoral eficaz. Los estudios de vacunación con DC661-MC38 se repitieron en ratones NOD/SCID. Estadísticas. La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de colas no apareadas de Student al comparar 2 grupos. Se utilizó la prueba ANOVA de 1-forma cuando se compararon más de 2 grupos. Se rechazó significativamente una hipótesis nula si el valor de p era inferior a 0,05. Los datos se muestran como la media ± SEM. Aprobación del estudio. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.

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