Las células tumorales no logran presentar epítopos restringidos por MHC-II derivados de oncogenes a las células T CD4+
Oct 09, 2023
Las células T CD4+ desempeñan un papel fundamental en la inmunidad antitumoral mediante el reconocimiento de antígenos peptídicos presentados en el MHC de clase II (MHC-II). Aunque se puede inducir que algunos cánceres sólidos expresen MHC-II, no está claro hasta qué punto esto permite el reconocimiento directo por parte de las células T CD4+ específicas del tumor. Aislamos y caracterizamos receptores de antígenos de células T (TCR) a partir de células T CD4+ preparadas de forma natural, específicas para 2 oncoproteínas, HPV-16 E6 y la mutación activadora KRASG12V, de pacientes con carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. y adenocarcinoma ductal pancreático, respectivamente, y determinaron su capacidad para reconocer células tumorales que expresan antígenos autólogos o humanos compatibles con antígenos leucocitarios. Descubrimos en ambos casos que los TCR eran capaces de reconocer células diana cargadas de péptidos que expresaban las células presentadoras de antígenos (APC) de células B o MHC-II relevantes cuando los antígenos se expresaban endógenamente y se dirigían a la vía endosómica, pero no reconocían el tumor. células que expresan la proteína fuente incluso después de la inducción de la expresión de MHC-II en la superficie por IFN- o transducción con CIITA. Estos resultados sugieren que el cebado y el reconocimiento funcional de una oncoproteína nuclear (E6) y asociada a la membrana (KRAS) se limitan predominantemente a las APC de presentación cruzada en lugar de mediante el reconocimiento directo de células tumorales inducidas a expresar MHC-II.
Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral
Introducción
La transformación maligna de las células somáticas se inicia mediante la acción de oncogenes activados que desregulan las vías de crecimiento celular y conducen a una proliferación descontrolada (1). En el caso de los cánceres asociados al VPH, la expresión de los genes tempranos del VPH E6 y E7 contribuye a la oncogénesis al inhibir los genes supresores de tumores p53 y Rb, respectivamente (2). Alternativamente, la activación constitutiva de oncogén puede ocurrir a través de mutación somática en genes que regulan el crecimiento celular y las vías de proliferación, como la familia RAS. De hecho, las mutaciones activadoras de KRAS, como KRASG12V, se encuentran comúnmente en pacientes con cáncer de páncreas, colon y pulmón (3). Aunque los oncogenes promueven enfermedades, también pueden proporcionar objetivos para el sistema inmunológico del huésped. En los últimos años, se ha reconocido ampliamente el papel del sistema inmunológico en el control de los cánceres asociados al VPH. Se han identificado células T CD8+ y CD4+ que reconocen los VPH E6 y E7, así como otras proteínas del VPH, tanto en la sangre periférica como en los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de pacientes con VPH asociado. cánceres (4–6). Las inmunoterapias dirigidas a estos antígenos, incluidas las vacunas terapéuticas contra el cáncer y la terapia celular adoptiva (ACT) con TIL o células T diseñadas con TCR, son un área activa de investigación preclínica y clínica (2). También se han descrito ampliamente las respuestas de las células T contra mutaciones oncogénicas (7–9). Además, existe evidencia clínica directa de que ACT con TIL dirigidos a KRAS mutante puede promover respuestas objetivas (10). Aunque las células T CD8+ que reconocen epítopos derivados de oncogenes median la citotoxicidad directa contra las células tumorales (11–13), el papel de las células T CD4+ en la inmunidad antitumoral no se comprende tan bien. Estudios recientes han destacado un subconjunto de células T CD4+ que expresan marcadores citotóxicos, como la granzima B (GrzmB), en cánceres humanos (14, 15). Sin embargo, las especificidades antigénicas de estas células y, por tanto, su potencial terapéutico, siguen siendo en gran medida desconocidas. Además, para que estas células T CD4+ citotóxicas reconozcan y eliminen las células tumorales, la célula tumoral no solo debe expresar MHC-II, sino que también los antígenos relevantes deben dirigirse a la vía de presentación adecuada. En este estudio, investigamos la capacidad de las células T CD4+ específicas de las oncoproteínas HPV-16 E6 y KRASG12V para reconocer células tumorales que expresan antígenos. Aunque ambos TCR fueron capaces de reconocer directamente antígenos procesados y presentados endógenamente dirigidos al compartimento endosómico de células B compatibles con HLA, ninguno fue capaz de reconocer células tumorales que expresan antígenos con expresión inducida de MHC-II. En general, nuestros resultados sugieren que solo ciertos antígenos se presentan directamente en las células tumorales MHC-II+, lo que puede limitar el conjunto de células T CD4+ capaces de reconocer y eliminar directamente las células tumorales.
Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.
Haga clic aquí para ver los productos Cistanche Enhance Immunity
【Pregunte por más】 Correo electrónico:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Resultados
Identificación de las respuestas de las células T CD4+ y CD8+ específicas del VPH-16E6-específicas de los TIL del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Examinamos una serie de cultivos de TIL individuales aislados de fragmentos tumorales de 2 a 4 mm de un paciente (Hu-56) con carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) de VPH-16+ (Tabla complementaria 1; material complementario disponible en línea con este artículo; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) mediante ensayos de IFN-ELISPOT para identificar respuestas de células T dirigidas contra las oncoproteínas virales E6 y E7 del VPH-16, utilizando grupos de péptidos que comprenden 15-meros superpuestos que abarcan la longitud de las proteínas E6 y E7. En particular, los fragmentos TIL 12 y 29 generaron una cantidad sustancial de manchas sobre el fondo cuando se reestimularon con el conjunto de péptidos E6 y contenían células T CD4+ y CD8+ (Figura 1A y Figura 1A complementaria). Para identificar los subconjuntos de células T relevantes, analizamos estos cultivos de TIL mediante un ensayo de secreción de citocinas. Esto reveló que el fragmento 29 (F29) de TIL contenía células T E6-CD8+ reactivas, mientras que el fragmento 12 (F12) contenía células T CD4+ y CD8+ capaces de reconociendo el grupo de péptidos E6 (Figura 1B). Ninguna de las células T CD4+ produjo IL-5 en respuesta a la reestimulación de E6, lo que valida un fenotipo similar a Th1-. Para determinar la clonalidad de TCR de TIL específicos de E6-, clasificamos las células T CD4+ secretoras de IFN individuales de F12 y las células T CD8+ de F12 y F29. La secuenciación de TCR reveló un único TCR expresado por células T CD4+ secretoras de IFN- (n=31 de 31 células secuenciadas), así como un único clon de TCR compartido por CD{{53 secretora de IFN-). }} células T de F12 y F29 (n=40 de 41 y 37 de 38 células secuenciadas, respectivamente) (Tabla complementaria 2). Estos resultados indican que las células T monoclonales CD4+ y CD8+ reactivas a E6 están presentes en los TIL de este paciente. Las células T CD8+ restringidas a HLA-A*02:01 de TIL reconocen E6 presentado por una línea celular tumoral derivada del paciente. Los TIL de F29 produjeron IFN- cuando se reestimularon con el péptido E629-38, lo que sugiere que el TCR F29 reconoció este epítopo restringido a HLA-A*02:01 descrito previamente (Figura 1B complementaria) (11). Esto se confirmó mediante estudios de unión de tetrámeros utilizando E629-38/HLA-A*02:01 para marcar células J76 deficientes en TCR que expresan CD8 humano y utilizando un TCR específico de E628-38 previamente descrito como positivo. control (Figura 2A) (11). Ambos TCR exhibieron niveles similares de avidez funcional, como lo demuestra la regulación positiva del marcador de activación aguda CD69 en J76 después de la estimulación con líneas celulares linfoblastoides B autólogas (B-LCL) pulsadas con concentraciones tituladas de péptido E629-38 (Figura 2, B y C). Estos datos validan la presencia de un clon de células T CD8+ específico para un epítopo conocido de E6 con características funcionales similares a un TCR que se ha probado en un entorno clínico (16). A continuación, intentamos determinar si el TCR CD8+ específico de E6-podría reconocer antígenos expresados endógenamente y, por tanto, mediar en la citotoxicidad antitumoral. Para ello, utilizamos una línea tumoral HLA-A*02:01+VPH-16+ bien caracterizada, CaSki, así como una línea celular tumoral autóloga, HNSCC-56, generada a través de reprogramación celular de tejido tumoral primario como se describió previamente (17) para ensayos de citotoxicidad in vitro. El análisis RNA-Seq validó la expresión de los genes tempranos del VPH, incluido el E6, tanto en la muestra del tumor primario como en la línea celular autóloga (Figura 1C complementaria). Las células T CD8+ humanas primarias que expresan el TCR F29 podrían mediar en la destrucción celular tanto de CaSki como de HNSCC-56 en una variedad de proporciones efector-objetivo in vitro (Figura 2, D y E). En conjunto, estos datos validan que el TCR F29 reconoce el antígeno E6 expresado endógenamente. Identificación de una célula T CD4+ específica de E6-restringida a HLA-DQ a partir de TIL. Para expandir los TIL específicos de E6- para un análisis funcional adicional, utilizamos el protocolo de cultivo de expansión rápida descrito anteriormente con OKT-3 y PBMC alogénicas irradiadas para expandir los TIL de F12. Aunque el cultivo primario F12 contenía originalmente células T CD8+ y CD4+ con reactividad E6, el producto celular final después de una rápida expansión contenía 99 % de células T CD4+, de las cuales aproximadamente 38,33 % demostró reactividad contra E6, como lo demuestra la tinción de citoquinas intracelulares para IFN- (Figura 3A).
Planta de hierba china cistanche-Antitumoral
Además de IFN-, los CD4+ TIL específicos de E6-específicos estimulados podrían secretar TNF- pero no IL-2 (Figura 2A complementaria). Aunque la frecuencia total de las células GrzmB+ no aumentó con la estimulación antigénica, la activación de las células secretoras de TNF- reveló que los TIL CD4+ específicos de E6-contenían más GrzmB intracelular almacenado que los TIL no específicos (Figura complementaria 2B). ). Los CD4+ TIL secretores de IFN también expresaron el marcador coinhibidor de muerte celular programada 1 (PD-1), de acuerdo con las firmas publicadas de CD4+ TIL reactivos a tumores (Figura 2C complementaria) ( 18, 19). Los CD4+ TIL específicos de E6-específicos demostraron una alta avidez funcional porque estas células podían secretar citocinas en concentraciones de péptidos inferiores a 1 ug/ml (Figura 3B). Para determinar la especificidad del cultivo de TIL F12, pulsamos B-LCL autólogas con péptidos individuales correspondientes a cada uno de los 37 péptidos contenidos en el conjunto E6 original (Tabla complementaria 3). Los CD4+ TIL de F12 secretaron IFN- cuando se estimulan con los péptidos E61-15 y E65-19, que comparten una secuencia central de 11 aminoácidos (Figura 2D complementaria). Los experimentos de cocultivo en presencia de Abs bloqueadores de HLA revelaron una secreción de IFN- significativamente disminuida por los TIL cuando los B-LCL se bloquearon con Abs anti-HLA-DQ pero no con Abs anti-HLA-DR o de control de isotipo (Figura 3C). Para determinar qué alelos HLA-DQ son responsables de la presentación de este epítopo, pulsamos B-LCL que expresan alelos HLA-DQ conocidos (Tabla complementaria 4) con E61-15 y encontramos que las células KAS011 que expresan HLA-DQA1*01 :02 y DQB1*05:02, pero no Hu-195 B-LCL que expresan DQA1*05:05 y DQB1*03:01, podrían presentar antígeno a los TIL de una manera comparable al Hu{{63} autólogo } B-LCL (Figura 3D). Finalmente, intentamos verificar que la secuencia de TCR identificada previamente era realmente responsable del reconocimiento de E6. La expresión del TCR F12 en células T CD4+ de donantes humanos sanos primarios fue suficiente para promover el reconocimiento del péptido E61-15, como lo demuestra la regulación positiva de CD69 y PD-1 (Figura 3E ). En conjunto, estos resultados demuestran la identificación de un epítopo de E6 restringido a HLA-DQ reconocido por los CD4+ TIL monoclonales. Las células T E6-CD4+ específicas no reconocen ni destruyen células tumorales autólogas que expresan MHC-II. Estudios recientes han identificado firmas genéticas de CD4+ TIL citotóxicos en algunos cánceres humanos (14, 15). Sin embargo, se desconoce si las células T CD4+ citotóxicas desempeñan un papel en los cánceres provocados por el VPH. Para determinar si las células T CD4+ específicas de E6-de TIL podrían reconocer directamente HNSCC-56, primero investigamos su estado de expresión de MHC-II. Aunque las células tumorales no expresaron MHC-II de superficie detectable en cultivo, el tratamiento con IFN- durante 72 horas fue suficiente para inducir una regulación positiva de MHC-II (Figura 4A). A continuación, cultivamos HNSCC-56 con CD4+ F12 TIL. Es importante destacar que las células tumorales MHC-II+ preacondicionadas con IFN- no pudieron estimular los CD{99}} TIL medidos por la secreción de IFN- (Figura 4B).
Figura 1. Identificación de E6-CD4+ y CD8+ TIL reactivos de HPV-16+ HNSCC. (A)
Figura 2. Características funcionales de un TCR específico de E6- restringido a HLA-A*02:01 de Hu-56 TIL. (A)
Sin embargo, las líneas celulares tumorales tratadas con IFN pulsadas con E61-15 antes de la adición de TIL pudieron estimular una respuesta de células T, lo que indica que la expresión superficial de los alelos restrictivos HLA-DQ en una línea celular que expresa endógenamente E6 no fue suficiente para el reconocimiento del tumor pero requirió una carga exógena del péptido diana. El mismo requisito de carga de péptido diana exógeno se observó con células tumorales transducidas con CIITA (HNSCC-56 CIITA), que expresan constitutivamente altos niveles de MHC-II de superficie (Figura 4B). Para probar si los CD4+ TIL podrían reconocer una versión procesada y presentada endógenamente del epítopo E6 en una APC, transdujimos retroviralmente B-LCL autólogas con una construcción de expresión que codifica los primeros 50 aminoácidos de E6 fusionados al MHC- Dominio transmembrana I (E6-MITD), que induce la localización de la secuencia de aminoácidos fusionada en la membrana plasmática y apoya la presentación en MHC-II a través del tráfico endosómico (20). Los B-LCL que expresan la construcción E6-MITD podrían estimular los TIL CD4+ específicos de E6-específicos, lo que indica que el epítopo peptídico reconocido por estos TIL se puede procesar y presentar de forma natural en el MHC-II cuando dirigido a la vía adecuada (Figura 4C).
Figura 3. Características funcionales de CD4+ TIL específicos de E6-específicos de E4+, restringidos por HLA-DQ y expandidos clonalmente. (A)
A continuación, intentamos determinar si los TIL CD4+ específicos de F12 E6-eran capaces de producir citotoxicidad tumoral directa. De acuerdo con los datos de nuestros ensayos de reconocimiento, los CD4+ TIL específicos de E6-específicos no pudieron limitar el crecimiento de las células tumorales HNSCC-56, que no expresan MHC-II (Figura 4D). . Además, las células tumorales HNSCC-56 CIITA también crecieron sin inhibiciones en presencia de CD4+ TIL. Sin embargo, el crecimiento de células tumorales HNSCC-56 CIITA pulsadas con péptido E61-15 se inhibió de una manera dependiente de la dosis de las células efectoras. En general, estos datos sugieren que aunque HNSCC-56 puede presentar epítopos E6 a las células T CD8+, los CD4+ TIL específicos de E6-específicos no pueden reconocer ni lisar directamente MHC- II+ células tumorales autólogas. Los genes implicados en la presentación de antígenos suelen mutar en los cánceres, lo que puede impedir el reconocimiento por parte de las células T (21). Para determinar si las células tumorales HNSCC-56 contenían alguna mutación somática que impidiera la presentación del antígeno en MHC-II, realizamos una secuenciación del exoma completo de células tumorales y PBMC de Hu-56 como muestra de referencia. De las 104 mutaciones somáticas no sinónimas identificadas, no hubo mutaciones aparentes en los componentes de la vía de presentación del MHC-II, incluidos HLADMA, HLADMB y CD74 (Tabla complementaria 5). Identificación de un TCR específico de KRASG12V restringido a HLA-DRB5*01:01 a partir de la sangre de un paciente con adenocarcinoma ductal de páncreas. Tras estos resultados, nos propusimos determinar si la incapacidad de las células tumorales para presentar antígenos en el MHC-II era cierta para otros oncogenes. Dado que se han identificado células T circulantes específicas de tumores en pacientes humanos con cáncer (8, 22), estimulamos PBMC de un paciente (Hu-66) con adenocarcinoma ductal pancreático (Tabla complementaria 1) con un conjunto de péptidos. correspondientes a mutaciones oncogénicas comunes (Tabla complementaria 6) durante 14 días antes de la reestimulación con péptidos individuales para identificar respuestas de células T relevantes mediante ELISPOT. Estos resultados indicaron la presencia de una respuesta de células T dirigida contra KRASG12V, como lo demuestra un mayor número de manchas de IFN- en el fondo en respuesta a los aminoácidos 1 a 15 de KRASG12V (Figura 5A). Para identificar los TCR relevantes asociados con esta respuesta, utilizamos nuevamente el ensayo de secreción de citoquinas para clasificar las células secretoras de IFN. El ensayo de secreción de citocinas reveló una producción específica de IFN- por parte de las células T CD4+ en respuesta a la reestimulación con KRASG12V (Figura 5B). La comparación de las cadenas de TCR de células secretoras de IFN-clasificadas con las presentes en PBMC no expandidas de este paciente reveló un único clonotipo de TCR presente con la frecuencia más alta entre ambas poblaciones (Figura 5C y Tabla complementaria 2). Estos resultados indican que la frecuencia de este clon de células T se expandió al inicio del estudio en PBMC, lo que sugiere una respuesta in vivo que surge naturalmente en lugar de un cebado in vitro en nuestro cultivo de expansión. Para verificar la especificidad antigénica de este TCR, lo expresamos en células T CD4+ humanas primarias mediante transducción retroviral y cultivamos estas células con B-LCL autólogas pulsadas con el mutante KRASG12V o el péptido WT correspondiente. Las células T modificadas secretaron IFN- cuando se estimularon con el péptido KRAS mutante, pero no WT, verificando que este TCR es específico para KRASG12V (Figura 5D). De acuerdo con nuestros resultados del TCR E6, las células T diseñadas que expresan el TCR específico de KRASG12V también fueron capaces de reconocer B-LCL que expresan un fragmento de KRASG12V, pero no WT KRAS, dirigido al endosoma mediante la inclusión de un MITD, lo que sugiere que esto TCR reconoce el antígeno presentado y procesado endógenamente (Figura 5D).
Figura 4. Las células tumorales autólogas no presentan E61-15 endógena en MHC-II a las células T CD4+. (A)
Figura 5. Identificación de un TCR específico de KRASG12V restringido a HLA-DRB5*01:01 a partir de la sangre de un paciente con adenocarcinoma ductal de páncreas. (A)
Para identificar el alelo HLA restrictivo, repetimos estos experimentos de estimulación peptídica utilizando B-LCL que expresan diferentes combinaciones de genes HLA. Las B-LCL que expresan el haplotipo común HLA-B7-DR15-DQ6 podrían estimular las células T diseñadas, mientras que las B-LCL sin estos alelos no podrían (Figura 5E). En última instancia, la estimulación de estas células mediante IHW03304 pulsado con péptido, una línea celular DAP3 de ratón transfectada con HLA-DRB5*01:01 humano, verificó que esto fuera la molécula HLA restrictiva (Figura 5F). Las células tumorales MHC-II+ NCI-H2444 y DAN-G no presentan un epítopo derivado de KRASG12V para las células T CD4+. A continuación, investigamos la capacidad de las células tumorales para presentar directamente epítopos derivados de KRASG12V en MHC-II. Para generar líneas celulares MHC-II+ compatibles con HLA para estos estudios, transdujimos las líneas celulares KRASG12V+ NCI-H2444 y DAN-G, derivadas de cánceres de pulmón y páncreas humanos, respectivamente, con CIITA y una construcción que codifica HLA-DRB5*01: 01 con un gen indicador CD34 truncado (Figura 6A). De acuerdo con nuestros resultados anteriores, las células tumorales MHC-II+ que expresaban el alelo HLA restrictivo no pudieron estimular las células T diseñadas con TCR a menos que las células diana fueran pulsadas primero con un péptido exógeno (Figura 6B). Es importante destacar que no se enumeraron mutaciones somáticas en los genes de presentación del MHC-II (es decir, HLADMA, HLADMB, CD74) ni para NCI-H2444 ni para DAN-G en los datos de secuenciación disponibles públicamente (23). Las células NCI-H2444 CIITA crecieron sin inhibiciones en presencia de células T diseñadas con TCR, mientras que las células NCI-H2444 CIITA pulsadas con el péptido KRASG12V experimentaron un crecimiento tumoral retrasado (Figura 6C). De acuerdo con los resultados obtenidos para HNSCC-56, las células T CD8+ que expresan un TCR específico de KRASG12V restringido a HLA-A*03:01 (24) pudieron reconocer las células NCI-H2444, pero no Células CaSki, que expresan HLA-A*03:01 pero no KRASG12V (Figura 6D). Estos resultados demuestran que las células tumorales MHC-II+ tampoco pueden presentar un oncogén distinto presente en el citosol a pesar de estar presentado eficazmente en MHC-I. La expresión de ligandos coinhibidores como el ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1) por células tumorales limita la señalización de TCR en las células T (25). Para determinar si este mecanismo puede estar impidiendo el reconocimiento de células tumorales MHC-II+ por parte de las células T CD4+, cultivamos células T CD4+ que expresan nuestro TCR específico de KRASG12V o el E6-específico. F12 TCR con NCI-H2444 CIITA y HNSCC-56 CIITA, respectivamente, con o sin Abs bloqueadores anti-PD-L1. El bloqueo de las interacciones PD-L1/PD-1 no fue suficiente para promover el reconocimiento de las células tumorales (Figura 3 complementaria). De manera similar, la adición de Ab agonista anti-CD28 no moduló el reconocimiento de células tumorales. Estos resultados sugieren que la responsable de este fenotipo es la falta de presentación del antígeno, más que la presencia o ausencia de señales coinhibidoras o coestimuladoras, respectivamente. Algunos estudios sugieren que las proteínas endógenas internalizadas desde la membrana plasmática se cargan preferentemente en el MHC-II para su presentación, en comparación con otros compartimentos subcelulares (26). Aunque las proteínas KRAS se asocian frecuentemente con las membranas mediante modificaciones de lípidos, no expresan un dominio transmembrana y estas interacciones no son estables (3, 27). Por lo tanto, razonamos que anclar el fragmento inmunogénico de KRASG12V a la membrana plasmática de las células tumorales puede permitir el reconocimiento directo del antígeno por parte de las células T CD4+. Sin embargo, las células tumorales que expresan la construcción KRASG12V-MITD, como lo demuestra la expresión de un indicador EGFP vinculado a P2A, tampoco pudieron estimular las células T CD4+ diseñadas con TCR (Figura 4 complementaria). Estos resultados sugieren que la localización del oncogén subcelular no es el único determinante de la presentación directa del MHC-II por las células tumorales. Además, estos resultados sugieren que la sobreexpresión del antígeno no es suficiente para promover la presentación de MHC-II. Nuestros resultados hasta el momento sugieren que las células T CD4+ específicas de tumores pueden tener más probabilidades de reconocer los antígenos presentados por las APC que por las propias células tumorales. Por lo tanto, evaluamos la capacidad de HLADRB5*01:01+ DC para presentar antígenos derivados de proteínas exógenas. Las CD con HLA compatibles generadas in vitro fueron capaces de estimular células T CD4+ diseñadas con TCR que expresaban el TCR específico de KRASG12V cuando las CD inmaduras fueron pulsadas con el péptido 20-mero KRASG12V o alimentadas con proteína completa KRASG12V pero no proteína KRAS WT (Figura 6E). Estos resultados sugieren que, aunque el TCR no puede reconocer antígenos endógenos presentados por células tumorales, puede reconocer antígenos exógenos presentados de forma cruzada en el contexto de las CD.
cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico
Discusión
El objetivo de este estudio fue determinar si los TCR aislados de células T preparadas naturalmente obtenidas de pacientes con cáncer podrían reconocer células tumorales que expresan oncogenes. Con respecto al TCR de VPH-16E629-38 restringido de clase I (HLA-A*02:01), obtenido de HNSCC TIL, se confirmó, tal vez como era de esperar, el reconocimiento tanto de una línea celular tumoral autóloga y una célula tumoral bien caracterizada compatible con HLA y que expresa E6-, CaSki (es importante destacar que consulte la Figura 2). Los mismos TIL (Figura 1) también contenían números significativos de células T CD4+ específicas de E6-productoras de IFN (Figura 3), que, por el contrario, no reconocían E6- que expresan células tumorales, incluso cuando fueron inducidas a expresar MHC clase II de superficie amplia del alelo de presentación correcto (DQA1*01:02/DQB1*05:02) mediante tratamiento con IFN o transducción CIITA (Figura 4). La expresión de CIITA induce no solo la expresión superficial de las proteínas MHC-II sino también de HLA-DM y moléculas de cadena invariantes, que son necesarias para el procesamiento y la presentación de antígenos (28). Por el contrario, este TCR reconoció las células B compatibles con HLA cuando el antígeno se dirigió a la vía MHC-II. Se observó una situación similar en el caso de un TCR restringido a HLA-DRB5*01:01, específico de KRASG12V, que podía reconocer células B compatibles con HLA, pero no células tumorales que expresan MHC-II, cuando el antígeno se dirigía al Vía de presentación del MHC-II. Ambos TCR poseían suficiente avidez funcional para mediar en el reconocimiento de antígenos expresados endógenamente en las condiciones descritas anteriormente, y ambos podrían mediar en la citotoxicidad de células diana cargadas de péptidos. Esta última observación refleja la circunstancia presentada en varios informes sobre células T CD4+ citotóxicas, aunque nuestros datos amplían el contexto de esta observación al mostrar que la expresión endógena del antígeno fuente y la inducción de MHC-II por IFN- es poco probable. para producir un objetivo fisiológico en células tumorales derivadas de epitelio para TCR contra antígenos nucleares o asociados a membrana. Estudios recientes sobre cáncer de vejiga y melanoma humanos identificaron firmas genéticas correspondientes a células T CD4+ citotóxicas entre los TIL (14, 15). Funcionalmente, estos TIL CD4+ citotóxicos son capaces de reconocer tumores directamente dependientes de MHC-II, lo que en última instancia conduce a la lisis objetivo por parte de las granzimas de una manera similar a sus contrapartes CD8+. Sin embargo, la traducción terapéutica de estos hallazgos puede verse limitada por el hecho de que pocos tumores sólidos expresan MHC-II. De hecho, los resultados de dos estudios independientes sugirieron que sólo aproximadamente un tercio de los pacientes con melanoma tienen células tumorales MHC-II+, y la frecuencia de estas células dentro del tumor suele ser inferior al 10% (15, 29). En cambio, la fuente celular predominante de MHC-II en el microambiente tumoral parece ser la infiltración de leucocitos (26).
Figura 6. Las células tumorales MHC-II+ KRASG12V+ no presentan epítopos derivados de KRASG12V en las células T CD4+. (A)
Aunque algunas células de tumores sólidos expresan MHC-II constitutivo o inducible, nuestros resultados indican que a pesar de la presencia de células T CD4+ específicas de oncogén entre las TIL y las PBMC, estas células no pueden reconocer ni lisar directamente las células que expresan antígenos. células tumorales MHC-II+, mientras que los epítopos de la misma proteína pueden presentarse eficazmente a las células T CD8+ en MHC-I (13). Esto sugiere que la simple expresión de un antígeno diana puede no ser suficiente para conferir el reconocimiento por parte de las células T CD4+ del subconjunto de tumores que expresan MHC-II. Además, estos resultados parecen ser consistentes en múltiples tipos de tumores, porque las líneas celulares consultadas en este estudio incluyen aquellas derivadas de HNSCC, adenocarcinoma de pulmón y cáncer de páncreas. En 2 estudios se ha informado del reconocimiento directo de células T CD4+ de líneas celulares de melanoma que expresan MHC-II de forma natural o después de la transducción CIITA (30, 31). Sin embargo, en ambos estudios, una fracción significativa de los TCR analizados no reconocieron las células tumorales directamente. No está claro si estos TCR representan clonotipos "espectadores" que no reconocen antígenos tumorales o TCR específicos de tumores que no pueden reconocer su antígeno afín debido a deficiencias en la presentación de antígenos como las destacadas en este estudio. Oliveira et al. (31) demostraron que el reconocimiento directo por parte de las células T CD4+ estaba restringido a 2 melanomas con cargas mutacionales tumorales extremadamente altas, lo que sugiere que este fenotipo puede conferir alteraciones adicionales necesarias que permitan la presentación de antígenos tumorales por parte del MHC-II. Aunque la unión de un MITD al fragmento inmunogénico de KRASG12V no dio como resultado el reconocimiento directo de las células tumorales por parte de las células T CD4+, los estudios han descrito un sesgo hacia los péptidos endógenos derivados de proteínas unidas a la membrana eluidas del MHC-II, presumiblemente debido al reciclaje de membranas (26, 32). El antígeno de melanoma Trp1 existe en la membrana plasmática, lo que puede facilitar la presentación directa a las células T CD4+ por parte de las células tumorales B16 (33). Otro antígeno asociado al melanoma, el gp100, es presentado por las células tumorales a las células T CD4+ de una manera que depende del dominio transmembrana de gp100 (34). En un trabajo reciente que investiga el papel de las células T CD4+ específicas de neoantígeno en un modelo de sarcoma murino, se eluyeron epítopos derivados de una subunidad de integrina mutada, también una proteína unida a la membrana, del MHC-II en un tumor transducido con CIITA. células (35). Nuestros resultados sugieren que, aunque las proteínas unidas a la membrana pueden transportarse preferentemente a los endosomas para su presentación directa en MHC-II, la presencia de una proteína de membrana inmunogénica por sí sola no es suficiente para promover esta presentación. Se han descrito otras vías de presentación no clásicas que pueden permitir el acceso de proteínas citosólicas o nucleares al MHC-II, incluida la presentación asociada a la autofagia de proteínas intracelulares y la presentación dependiente del procesamiento de antígenos a las células T CD4+, por lo que las proteínas antigénicas Es de suponer que los péptidos se transfieren del MHC-I al MHC-II durante el reciclaje de la membrana (36, 37). Se ha informado del reconocimiento directo dependiente de MHC-II de células tumorales autólogas por células T CD4+ específicas para epítopos E7 (38, 39); sin embargo, ambos estudios se referían a proteínas E7 expresadas por subtipos de VPH oncogénicos menos prevalentes (a saber, VPH-33 y VPH-59) presentados por células de cáncer de cuello uterino en moléculas HLA-DR. Es posible, por lo tanto, que el subtipo de VPH, la histología del tumor y los alelos HLA restrictivos también puedan ser factores relevantes en la presentación diferencial de los antígenos nucleares del VPH en las células tumorales MHC-II+. Aunque nuestros datos sugieren que la citotoxicidad tumoral directa no es un mecanismo probable de las células T CD4+ específicas de E6- y KRASG12V, se han descrito otros mecanismos antitumorales de las células T CD4+, y La transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de tumores en pacientes con cáncer ha demostrado actividad antitumoral (7, 40, 41). Por lo tanto, los TCR restringidos por MHC-II, como los identificados en este estudio, pueden ser útiles para ACT en pacientes humanos, dado que dichos TCR se dirigen a epítopos derivados de oncoproteínas conductoras restringidas a haplotipos HLA estimados en 1,27% y 16,10% de los estadounidenses blancos. población, respectivamente, para HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 y HLA-DRB5*01:01 (42). En particular, las células T CD4+ ayudan en la preparación de células T CD8+ específicas de tumores al otorgar licencias para CD portadoras de antígenos de una manera dependiente de CD40L (43–45). Demostramos que el TCR específico de KRASG12V identificado en este estudio reconoce antígenos presentados de forma cruzada en el contexto de las CD, lo que sugiere que estas células pueden contribuir a la inmunidad antitumoral a través de esta función. Las células T CD4+ también pueden proporcionar ayuda local para las células T CD8+ dentro de los tumores al secretar citocinas como IL-2 e IFN-, lo que favorece la supervivencia de las células T CD8+ y reclutamiento al tumor (46). Además, los CD4+ TIL pueden reconocer antígenos en el microambiente tumoral de las células mieloides, como los macrófagos. De hecho, los estudios preclínicos han demostrado que, en ausencia de MHC-II en las células tumorales, las células T Trp1 CD4+ transferidas adoptivamente aún pueden ejercer inmunidad antitumoral dependiente del IFN- y correlacionarse con una mayor actividad citotóxica de los macrófagos (47). Sin embargo, este fenómeno parece depender de la secreción de antígenos tumorales, que también especularíamos que es mínima en el caso de la mayoría de los oncogenes. En general, nuestro estudio destaca la selectividad de la presentación directa de antígenos endógenos por parte de las células tumorales MHC-II+ y demuestra que ni la expresión de CIITA ni la presencia de un antígeno unido a la membrana son suficientes por sí solas para promover el reconocimiento directo de las células tumorales por parte de CD{{115} } Células T. Se necesitan más estudios para caracterizar qué antígenos pueden ser presentados directamente por las células tumorales MHC-II+ y en qué condiciones para comprender completamente las funciones dependientes del contexto de las células T CD4+ en el cáncer.
planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico
Métodos
Cultivo de células. Los TIL se recolectaron y cultivaron como se describió anteriormente (48). Brevemente, se diseccionó tejido tumoral primario en fragmentos de 2 a 3 mm, que se colocaron en una 24-placa de pocillos y se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 1{{102}}%. suero AB humano, penicilina-estreptomicina, HEPES, gentamicina y 6,000 UI/mL IL-2. Los TIL extravasados se cultivaron mediante reemplazos de medio medio cada 2 a 3 días. Se cultivaron células T humanas primarias de sangre periférica en un medio 50:50 que consistía en 50% de AIM V más 50% de RPMI-1640 suplementado con 10% de suero AB humano, penicilina-estreptomicina (100 U/ ml cada uno; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 UI/ml de IL-2, 5 ng/ml de IL-7 y 5 ng/ml de IL-15. Se generaron y cultivaron líneas celulares tumorales derivadas de pacientes como se describió anteriormente (17). Brevemente, el tejido tumoral primario se cortó en fragmentos de menos de 2 mm y se disociaron utilizando un GentleMACS Octo Disociator (Miltenyi Biotec). Las células tumorales se resuspendieron en medio F que contenía inhibidor de quinasa Rho 5 μM y se sembraron sobre un lecho de fibroblastos 3T3 irradiados (30 Gy). Después del cultivo inicial, las células tumorales se propagaron en una mezcla 3:1 de medio condicionado 3T3-irradiado y medio F que contenía inhibidor de quinasa Rho 5 μM. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L y B-LCL se mantuvieron en medio RPMI suplementado con l-glutamina y HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10 % FBS, piruvato de sodio 1 mM (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM de aminoácidos no esenciales (Gibco, Thermo Fisher Scientific) y penicilina-estreptomicina (100 U/ ml cada uno; Gibco). Mantuvimos 293GP (ATCC) en un suplemento de medio DMEM con FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina (100 U/ml cada uno; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Las células IHW03304, GM3107, KAS011, D8 y D66 fueron obsequios de Alessandro Sette (Instituto de Inmunología de La Jolla). Ensayos ELISPOT. Se sembraron TIL o PBMC a razón de 100,{67}} células por pocillo en placas ELISPOT recubiertas con antiIFN-Abs (1-D1K, Mabtech). Las células se reestimularon con grupos de péptidos HPV-16 E6 y E7 PepMix (JPT), grupos de péptidos que representan mutaciones oncogénicas seleccionadas o péptidos individuales indicados a 5 ug/mL para grupos o 10 ug/mL para péptidos durante 22 horas antes de desarrollarse. Placas ELISPOT según instrucciones del fabricante (Mabtech). Como control positivo, se utilizaron 5 ug/ml de fitohemaglutinina-L. Cultura de expansión ex vivo. Las PBMC se sembraron en placas con un conjunto de péptidos que representaban mutaciones oncogénicas seleccionadas a 5 ug/ml. Se añadió medio nuevo que contenía 10 UI/ml de IL-2 los días 4, 7 y 10. El día 14, se reestimularon las PBMC para su uso en ensayos ELISPOT o de secreción de citocinas. Secuenciación TCR. Se reestimularon TIL o PBMC con 5 ug/ml de HPV-16 E6 PepMix (JPT) o péptido KRASG12V, y las células secretoras de IFN se marcaron con fluorescencia utilizando el kit de ensayo de secreción de IFN humano según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). . Se clasificaron células individuales de IFN- + en una placa de 96-pocillos usando una FACSAria (BD Biosciences) y se realizó RNA-Seq usando un Illumina Miseq para identificar TCR y cadenas emparejadas. Para la identificación del clon de TCR CD4+ específico de E6-, las células secretoras de IFN- se clasificaron como se indicó anteriormente y las secuencias de TCR y TCR se amplificaron mediante PCR multiplexada anidada, como se describió anteriormente (49). Los productos de PCR se enviaron para secuenciación Sanger (ETON Biosciences). Para el análisis de frecuencia de TCR, las PBMC antes y después de 14- días de expansión ex vivo con los péptidos indicados se enviaron a Adaptive Biotechnologies. Análisis de expresión del VPH. Se aisló ARN de células tumorales primarias Hu-56 y de la línea celular tumoral y se envió para ARN-Seq en masa. Las lecturas de secuenciación de extremos emparejados se asignaron utilizando BWA (v0.7.12) (50) al genoma completo del VPH (n.º de acceso de GenBank NC_001526.2) y su transcriptoma correspondiente. El archivo de mapa de alineación de secuencia resultante se convirtió en un mapa de alineación binaria ordenado y se indexó, seguido de un conteo de lecturas mapeadas utilizando SAMtools (v1.2) (50). Secuenciación del exoma completo. La secuenciación del exoma completo y RNA-Seq se realizaron en el Sequence Core del Instituto de Inmunología de La Jolla utilizando kits de captura del exoma completo de Agilent e Illumina, respectivamente. El Moores Cancer Center distribuyó muestras biológicas FFPE a Tempus para su secuenciación de próxima generación junto con ADN de referencia compatible utilizando muestras de sangre periférica. Las lecturas de secuencia de la secuenciación del exoma del tumor y las muestras normales se alinearon con el genoma de referencia GRCh38 utilizando SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Las variantes del exoma se identificaron mediante SpeedSeq Somatic y las variantes se anotaron mediante SNPeff (v4.3i) (52). Los datos de secuenciación de RNA-Seq y del exoma completo para este manuscrito se cargaron en NCBI BioProject, número de acceso PRJNA924789. Transducción retroviral de células T. Las secuencias de nucleótidos de TCR se sintetizaron y clonaron en la columna vertebral del retrovirus MSGV1 utilizando un BioXP 3200 (Codex). La secuencia se optimizó con codones para su expresión en células humanas. Las regiones constantes del TCR humano se intercambiaron por regiones constantes del TCR de ratón con sustituciones para mejorar la expresión en la superficie y promover el emparejamiento preferencial (53, 54). Se aislaron PBMC humanas de capas leucocitarias. Las células T CD4+ o CD8+ se eliminaron mediante selección magnética y la fracción negativa que contenía todos los linfocitos restantes se cultivó en un medio de células T con 50 ng/ml de Ab anti-CD3 (OKT3) durante 2 días.
Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral
Los sobrenadantes retrovirales de TCR se generaron mediante cotransfección de células 293GP con el vector MSGV1 que contiene la secuencia de TCR relevante y el plásmido RD113. Dos días después de la transfección, los sobrenadantes retrovirales se recolectaron y se usaron frescos o congelados a -80 grados. Las transducciones se realizaron en placas recubiertas con RetroNectin (Takara), como se describió anteriormente (5). La expresión de la región constante de TCR murino se evaluó mediante citometría de flujo para determinar la eficiencia de la transducción. Las células T modificadas con TCR se utilizaron no antes del día 7 después de la estimulación inicial. Ensayos funcionales de células T. Cocultivamos 5 × 104 TIL, células T transducidas o células J76 Jurkat con 1 × 105 B-LCL pulsadas durante la noche con concentraciones indicadas de péptido o 5 × 103 células tumorales sembradas el día anterior en {{16} }bien placas con fondo en U o fondo plano, respectivamente. Cuando estaba indicado, se agregaron Abs agonistas anti-CD28 (clon CD28.2, BioLegend) o bloqueantes anti-PD-L1 (clon 29E.2A3, BioLegend) a cocultivos de células T y células tumorales a 5 y 10 ug/ml, respectivamente. Para los ensayos de citocinas y marcadores de activación, se utilizó 1x cóctel de activación celular (BioLegend) que contenía PMA e ionomicina como control positivo. Para estudios de bloqueo de HLA, se agregaron 20 ug/mL de los siguientes Abs a B-LCL pulsadas con péptidos al menos 2 horas antes de la adición de células T: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend), o control de isotipo IgG2a de ratón (MOPC-173, BioLegend). Cuando se indicó, las células tumorales se cultivaron durante 72 horas con 10 ng/ml de IFN-recombinante antes de la adición de células T. Los sobrenadantes se recogieron después de 18 a 24 horas, se midió el IFN- mediante ELISA (Thermo Fisher Scientific) y los sedimentos celulares se tiñeron para citometría de flujo. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron mediante cocultivo de células T con células tumorales en las proporciones indicadas de efector a objetivo. Brevemente, se sembraron y cultivaron 5 x 103 células tumorales durante la noche antes de agregar células T en las proporciones indicadas. La lisis de las células diana se determinó utilizando el analizador de células en tiempo real xCELLigence (ACEA Biosciences), que evaluó la impedancia eléctrica debida a la adherencia celular cada 30 minutos hasta el final del experimento. Los datos se analizaron utilizando el paquete de software xCELLigence RTCA y los resultados se informaron como un índice celular normalizado a 1 en el momento en que se agregaron las células T. Ensayo de presentación de MHC-II. Se generaron y clonaron en MSGV1 construcciones de ADN sintético que codifican lo siguiente utilizando un BioXP 3200 (Codex): los 25 aminoácidos N-terminales del gen HLA-B humano, seguidos de los primeros 50 aminoácidos de HPV-16 E6. o 25 aminoácidos de KRASG12V fusionados a los 55 aminoácidos C-terminales de HLA-B humano, un elemento de autoescisión de T2A y la secuencia codificante de EGFP. Los sobrenadantes virales se generaron como se describió anteriormente, y las B-LCL autólogas se transdujeron en placas recubiertas con RetroNectin después de estimulación durante la noche en un lecho de células 3T3 irradiadas (0,5 Gy) que expresaban CD40L humano (3T3-CD40L). La eficiencia de la transducción se evaluó mediante cuantificación por citometría de flujo de la expresión de EGFP. Las B-LCL transducidas se estimularon con 3T3-CD40L en presencia de 200 UI/ml de IL-4 humana recombinante (PeproTech) durante 2 rondas sucesivas de 2 a 3 días antes del cocultivo con TIL autólogas. Generación de DC para ensayos de presentación de antígenos. Las CD se generaron utilizando el método de adherencia plástica. Las PBMC congeladas se descongelaron y se sembraron en medio DC (RPMI-1640 suplementado con l-glutamina, suero AB humano inactivado por calor al 5 % y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina) durante 2 horas a 37 grados. Las células no adherentes se eliminaron mediante lavado con PBS tibio y las células adherentes se cultivaron en medio DC suplementado con 800 U/ml de GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) y 500 U/ml de IL-4 (PeproTech) durante 6 días. . Agregamos 1 ug/ml de péptido KRASG12V o 20 ug/ml de proteína KRASG12V o WT KRAS (Abcam) directamente a las CD inmaduras durante la noche. Al día siguiente, las CD se recolectaron y se cultivaron conjuntamente con células T diseñadas con TCR en una proporción de 1:1 durante la noche antes de evaluar la regulación positiva de CD137 mediante citometría de flujo. Transducción retroviral de células tumorales. La secuencia codificante de CIITA humana fue sintetizada (Integrated DNA Technologies) y clonada en MSGV1 por Gibson Assembly. Las secuencias codificantes de HLADRB5*01:01 y las cadenas separadas por una secuencia P2A se sintetizaron (Integrated DNA Technologies) y se clonaron en un vector lentiviral pHAGE modificado cadena arriba de una secuencia T2A seguida de una secuencia indicadora CD34 truncada por Gibson Assembly. Se generaron sobrenadantes retrovirales con MSGV1, como se describió anteriormente. Los sobrenadantes lentivirales se generaron mediante cotransfección de células 293T con plásmidos pHAGE, tat, rev, gag/pol y vsv-g. Los sobrenadantes virales se recogieron 24 horas después y se concentraron mediante centrifugación en tubos Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Se sembraron células tumorales y, 1 día después, se reemplazó el medio con sobrenadante retroviral o lentiviral suplementado con 10 ug/ml de polibreno. Cuatro horas más tarde, se aspiró el sobrenadante que contenía el virus y se reemplazó con un medio de cultivo. Las células tumorales MHC-II+ y CD34+ se clasificaron utilizando un clasificador de células FACS Fusion (BD Biosciences). Citometría de flujo. Las células se marcaron con Abs monoclonales conjugados con fluorocromo para los siguientes antígenos: CD3-PE antihumano (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-cianina7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) y TCR -APC anti-ratón (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Las células muertas se tiñeron con DAPI o LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–El tetrámero PE fue ensamblado y etiquetado por el NIH Tetramer Core Facility. Las células se tiñeron con 1 ug/ml de tetrámero durante 1 hora en hielo. La tinción Ab para antígenos de superficie se realizó durante 15 minutos en hielo. Para la tinción de citocinas intracelulares (ICS), las células T se cultivaron conjuntamente con APC pulsadas con péptidos durante 4 a 6 horas en presencia de Brefeldin A. Las células se permeabilizaron y se tiñeron para detectar citocinas intracelulares con el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) después de la tinción de la superficie. , según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes Abs conjugados con fluorocromo para la tinción de citoquinas: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11 , BioLegend) y Granzima B – PE (QA16A02, BioLegend). Los datos se adquirieron con un citómetro de flujo FACSCelesta (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo v10.7. Estadísticas. Los análisis estadísticos se realizaron con Prism 8 (software GraphPad). Para las comparaciones de ICS, se utilizó una prueba t de colas 2-no apareadas. Para comparar la supresión de la señalización de células T mediada por Ab que bloquea HLA y Ab, se utilizó un método ANOVA. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Aprobación del estudio. Las muestras humanas no identificadas utilizadas en este estudio se obtuvieron bajo consentimiento informado a través del protocolo 101391CX del IRB de UCSD, "Fenotipado del entorno tumoral y aislamiento celular". Los individuos en el estudio proporcionaron su consentimiento informado por escrito.
Referencias
1. Hanahan D, Weinberg RA. Características del cáncer: la próxima generación. Celúla. 2011;144(5):646–674.
2. Shamseddine AA, et al. Inmunidad tumoral e inmunoterapia para los cánceres relacionados con el VPH. Descubrimiento del cáncer. 2021;11(8):1896–1912.
3. Simanshu DK, et al. Revisión de vanguardia de las proteínas RAS y sus reguladores en enfermedades humanas. Celúla. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Un repertorio policlonal inesperadamente grande de células T específicas del VPH está preparado para actuar en pacientes con cáncer de cuello uterino. Res. Cáncer. 2010;70(7):2707–2717.
5. Stevanović S, et al. Panorama de antígenos tumorales inmunogénicos en la inmunoterapia exitosa del cáncer epitelial inducido viralmente. Ciencia. 2017;356(6334):200–205.
6. Bhatt KH, et al. El perfilado de las respuestas de las células T específicas del VPH-16- revela amplias reactividades antigénicas en pacientes con cáncer de orofaringe. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.
7. Veatch JR, et al. Las células T CD4 + específicas de BRAF V600E infiltrantes de tumores se correlacionan con una respuesta clínica completa en el melanoma. J Clin invertir. 2018;128(4):1563–1568.
8. Veatch JR, et al. Las células T CD4+ endógenas reconocen neoantígenos en pacientes con cáncer de pulmón, incluidas las mutaciones conductoras oncogénicas recurrentes KRAS y ERBB2 (Her2). Cáncer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.
9. Cafri G, et al. Células T de memoria que se dirigen a mutaciones oncogénicas detectadas en sangre periférica de pacientes con cáncer epitelial. Comuna Nacional. 2019;10(1):449.
10. Tran E, et al. Terapia de transferencia de células T dirigida a KRAS mutante en el cáncer. N Inglés J Med. 2016;375(23):2255–2262.
11. Draper LM, et al. Dirigirse a las células cancerosas epiteliales del VPH -16+ mediante células T modificadas mediante ingeniería genética TCR dirigidas contra E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.
12. Jin BY, et al. Las células T diseñadas dirigidas a E7 median la regresión de los cánceres del virus del papiloma humano en un modelo murino. Perspectiva de la JCI. 2018;3(8):e99488.
13. Oso AS, et al. La caracterización bioquímica y funcional de los epítopos KRAS mutantes valida esta oncoproteína para su orientación inmunológica. Comuna Nacional. 2021;12(1):4365.
14. Oh DY, et al. Las células T CD4+ intratumorales median la citotoxicidad antitumoral en el cáncer de vejiga humano. Celúla. 2020;181(7):1612–1625.
15. Cachot A, et al. Las células T CD4 citolíticas específicas de tumores median la inmunidad protectora contra el cáncer humano. Ciencia avanzada. 2021;7(9):eabe3348.
16. Doran SL, et al. Terapia génica con receptores de células T para cánceres epiteliales asociados al virus del papiloma humano: un primer estudio de fase I/II en humanos. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.
17. Liu X, et al. Reprogramación condicional y expansión a largo plazo de células normales y tumorales a partir de muestras biológicas humanas. Protocolo Nacional. 2017;12(2):439–451.
18. Veatch JR, et al. Las células T CD4+ específicas de neoantígeno en el melanoma humano tienen diversos estados de diferenciación y se correlacionan con la función de las células T CD8+, los macrófagos y las células B. Célula cancerosa. 2022;40(4):393–409.
19. Lowery FJ, et al. Firmas moleculares de células T antitumorales reactivas a neoantígenos de cánceres humanos metastásicos. Ciencia. 2022;375(6583):877–884.
20. Kreiter S, et al. Aumento de la eficiencia de presentación de antígenos mediante el acoplamiento de antígenos a señales de tráfico de MHC de clase I. J Inmunol. 2008;180(1):309–318.
21. Zaretsky JM, et al. Mutaciones asociadas con la resistencia adquirida al bloqueo de PD-1 en melanoma. N Inglés J Med. 2016;375(9):819–829.
22. Gros A, et al. Reconocimiento de neoantígenos del cáncer gastrointestinal humano mediante linfocitos PD-1+ circulantes. J Clin invertir. 2019;129(11):4992–5004.
23. Scholtalbers J, et al. TCLP: un catálogo en línea de líneas celulares cancerosas que integra el tipo HLA, los neoepítopos previstos, los virus y la expresión genética. Genoma Med. 2015;7(1):118.
24. Juneja V, Choi J, inventores; BioNTech US Inc., cesionaria. Construcciones de receptores de células T y usos de las mismas. Patente estadounidense nº US202103040215A1. 4 de noviembre de 2021.
25. Sharpe AH, Pauken KE. Las diversas funciones de la vía inhibidora de PD1. Nat Rev Inmunol. 2018;18(3):153–167.
26. Abelin JG, et al. La definición de reglas de unión y procesamiento del ligando HLA-II con espectrometría de masas mejora la predicción del epítopo del cáncer. Inmunidad. 2019;51(4):766–779.
27. Silvio JR, et al. K-ras4B y las proteínas preniladas que carecen de "segunda señal" se asocian dinámicamente con las membranas celulares. Célula Mol Biol. 2006;17(1):192–202.
28. Chang CH, Flavell RA. El transactivador de clase II regula la expresión de múltiples genes implicados en la presentación de antígenos. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.
29. Rodig SJ, et al. Las proteínas MHC confieren sensibilidad diferencial al bloqueo de CTLA-4 y PD-1 en melanoma metastásico no tratado. Ciencia Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.
30. Ahmadzadeh M, et al. Las células T reguladoras CD4+ humanas que se infiltran en tumores muestran un repertorio de TCR distinto y exhiben reactividad tumoral y neoantígena. Ciencia inmunol. 2019;4(31):eaao4310.
31. Oliveira G, et al. El panorama de las células T CD4+ antitumorales reguladoras y auxiliares en el melanoma. Naturaleza. 2022;605(7910):532–538.
32. Roca KL, et al. ¡Preséntate! Por moléculas MHC clase I y MHC clase II. Tendencias Inmunol. 2016;37(11):724–737.
33. Takechi Y, et al. Una proteína de la membrana melanosomal es un objetivo de la superficie celular para la terapia del melanoma. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.
34. Lepage S, Lapointe R. Las secuencias de direccionamiento melanosomal de gp100 son esenciales para la presentación y movilización de epítopos endógenos restringidos por MHC de clase II a compartimentos endosómicos. Res. Cáncer. 2006;66(4):2423–2432.
35. Alspach E, et al. Los neoantígenos MHC-II dan forma a la inmunidad tumoral y la respuesta a la inmunoterapia. Naturaleza. 2019;574(7780):696–701.
36. Dengjel J, et al. La autofagia promueve la presentación de péptidos de proteínas de origen intracelular en el MHC clase II. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2005;102(22):7922–7927.
37. Matsuzaki J, et al. Se requieren vías de procesamiento de antígenos no clásicas para el reconocimiento directo de tumores restringido por MHC de clase II por parte de las células T CD4+ específicas de NY-ESO-1-. Cáncer Immunol Res. 2009;2(4):341–350.
38. Höhn H, et al. Los linfocitos CD4+ infiltrantes de tumores en el cáncer de cuello uterino reconocen los péptidos restringidos por HLA-DR proporcionados por el virus del papiloma humano-E7. J Inmunol. 1999;163(10):5715–5722.
39. Höhn H, et al. Péptidos E7 del virus del papiloma humano tipo 33 presentados por HLA-DR*0402 a las células T infiltrantes de tumores en el cáncer de cuello uterino. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.
40. Lu YC, et al. Tratamiento de pacientes con cáncer metastásico utilizando un receptor de células T restringido de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad dirigido al antígeno de la línea germinal del cáncer MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.
41. Tran E, et al. Inmunoterapia contra el cáncer basada en células T CD4+ específicas de mutación en un paciente con cáncer epitelial. Ciencia. 2014;344(6184):641–645.
42. González-Galarza FF, et al. Actualización de 2020 de la base de datos neta de frecuencia de alelos (AFND): clasificación de datos estándar, datos de genotipos de acceso abierto y nuevas herramientas de consulta. Ácidos nucleicos res. 2020;48(d1): D783–D788.
43. Schoenberger SP, et al. La ayuda de las células T para los linfocitos T citotóxicos está mediada por interacciones CD40-CD40L. Naturaleza. 1998;393(6684):480–483.
44. Ahrends T, et al. Las células T CD4+ ayudan a conferir un programa efector de células T citotóxicas que incluye la regulación negativa del receptor coinhibidor y una mayor invasividad tisular. Inmunidad. 2017;47(5):848–861.
45. Ferris ST, et al. cDC1 ceba y está autorizado por las células T CD4+ para inducir inmunidad antitumoral. Naturaleza. 2020;584(7822):624–629.
46. Bos R, Sherman LA. Se requiere la ayuda de las células T CD4+ en el entorno tumoral para el reclutamiento y la función citolítica de los linfocitos T CD8+. Res. Cáncer. 2010;70(21):8368–8377.
47. Haabeth OAW, et al. El rechazo mediado por células T CD4+ de células tumorales positivas para MHC de clase II depende de la secreción de antígeno y de la presentación indirecta en las APC del huésped. Res. Cáncer. 2018;78(16):4573–4585.
48. Dudley ME, et al. Generación de cultivos de linfocitos infiltrantes de tumores para su uso en terapia de transferencia adoptiva para pacientes con melanoma. J Inmunother. 2003;26(4):332–342.
49. Dash P, et al. Análisis unicelular del repertorio de receptores de células T. Métodos Mol Biol. 2015;1343:181–197.
50. Li H, et al. El formato de alineación/mapa de secuencia y las herramientas SAM. Bioinformática. 2009;25(16):2078–2079.
51. Chiang C, et al. SpeedSeq: análisis e interpretación ultrarrápidos del genoma personal. Métodos Nat. 2015;12(10):966–968.
52. Cingolani P, et al. Un programa para anotar y predecir los efectos de polimorfismos de un solo nucleótido, SnpEff: SNP en el genoma de la cepa w1118 de Drosophila melanogaster; iso-2; ISO-3. Mosca (Austin). 2012;6(2):80–92.
53. Haga-Friedman A, et al. La incorporación de mutaciones hidrofóbicas transmembrana en el TCR mejora su expresión en superficie y la avidez funcional de las células T. J Inmunol. 2012;188(11):5538–5546.
54. Cohen CJ, et al. Actividad antitumoral mejorada de células T diseñadas para expresar receptores de células T con un segundo enlace disulfuro. Res. Cáncer. 2007;67(8):3898–3903.
