La vacunación con virus inactivado autógeno materno aumenta la inmunidad al PRRSV en lechones, parte 1

Abstracto:

La inmunidad derivada de la madre es un componente crítico para la supervivencia y el éxito de la descendencia en cerdos para protegerlos de los patógenos circulantes como el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino tipo 2 (PRRSV-2).

El propósito de este estudio es investigar la transferencia de inmunidad anti-PRRSV a lechones de primerizas que recibieron virus vivo modificado (MLV) solo (tratamiento (TRT) 0), o en combinación con uno de dos autógenos inactivados vacunas (AIVs, TRT 1 más 2). Los lechones de estas primerizas fueron desafiados con la cepa autógena de PRRSV-2 a las dos semanas de edad y se evaluó su respuesta inmune adaptativa (IR) hasta 4 semanas después de la inoculación (dpi).

Se analizó la IR humoral y celular sistémica en primerizas preparto, en lechones, preinoculación ya las 2 y 4 wpi. Ambos AIV protegieron parcialmente a los lechones con una patología pulmonar reducida y una mayor ganancia de peso; La TRT 1 también redujo la viremia de los lechones, lo que se explica mejor por la producción de anticuerpos neutralizantes inducida por AIV en las nulíparas y su transferencia a los lechones. En lechones, antes de la inoculación, los principales productores sistémicos de IFN fueron las células B CD21 plus. De 0 a 4 wpi, el papel de estas células B disminuyó y las células T CD4 se convirtieron en las principales productoras sistémicas de IFN-.

Los buenos virus vivos se refieren a virus que no causan enfermedades y tienen cierta relación con la inmunidad del cuerpo humano. Los virus vivos pueden estimular el sistema inmunitario humano para producir una respuesta inmunitaria, mejorando así la inmunidad humana. Los estudios han demostrado que después de que el cuerpo humano se infecta con un virus vivo, liberará algunos mediadores y citocinas, que pueden activar las células inmunitarias, promover la función del sistema inmunitario y mejorar la capacidad del cuerpo para resistir los virus.

Además, los virus benignos y viables también pueden ocupar células de manera competitiva, lo que dificulta que los patógenos invadan y se reproduzcan, protegiendo así al cuerpo humano de otras infecciones. Por lo tanto, una infección de virus vivo y benigna apropiada puede mejorar la inmunidad humana, pero una infección excesiva puede conducir a la enfermedad. Por lo tanto, en la vida diaria, las personas deben prestar atención a controlar la infección de virus vivos y mejorar la inmunidad a través de un estilo de vida saludable. Desde este punto de vista, necesitamos mejorar la inmunidad. Cistanche puede mejorar significativamente la inmunidad. La ceniza de carne contiene una variedad de ingredientes biológicamente activos, como polisacáridos, dos hongos y huangli, etc. Estos ingredientes pueden estimular varias funciones del sistema inmunológico. células similares a células, aumentando su actividad inmunológica.

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En los pulmones, los linfocitos T CD8 fueron los principales productores de IFN- y los linfocitos T CD4 fueron los secundarios, incluido un nuevo subconjunto de linfocitos T CD8-CCR7-CD4 porcinos, células TEMRA CD4 potencialmente diferenciadas terminalmente. En resumen, este estudio demuestra que la vacunación materna contra el AIV puede mejorar la protección de los lechones antes del destete contra el PRRSV-2; muestra la importancia de transferir anticuerpos neutralizantes a los lechones e introduce dos nuevos subconjuntos de células inmunitarias en cerdos: células B CD21 más productoras de IFN y células T CD8 −CCR7− CD4.

Palabras clave:

vacunación materna; vacuna autógena inactivada; transferencia de inmunidad; respuesta inmune humoral; respuesta inmune mediada por células; células T; PRRSV; cerdo; células B productoras de IFN; Células CD4 TEMRA.

1. Introducción

La inmunidad derivada de la madre (MDI) en los mamíferos es una sinfonía impresionante ("complejidad armoniosa"—[1]). En este sistema, o sinfonía, una madre transfiere protección inmunológica (temporal y/o duradera) a su descendencia ya sea durante la gestación a través de la placenta, después del nacimiento a través de las secreciones mamarias o ambas [2]: los humanos reciben inmunoglobulinas durante la gestación y eventualmente a través de las mamas. secreciones [3]; los perros y roedores reciben inmunoglobulinas durante la gestación ya través de las secreciones mamarias, y los cerdos y otros animales solo reciben inmunoglobulinas a través de las secreciones mamarias.

Al igual que otras especies, los lechones reciben este MDI en forma de inmunoglobulinas, células inmunitarias y otras moléculas relacionadas con el sistema inmunitario [4,5]. Si bien las inmunoglobulinas se pueden recibir de diferentes cerdas (= adopción cruzada), solo las madres biológicas pueden transferir con éxito células inmunitarias a sus crías [5], y la cantidad de ingesta de calostro en lechones reduce significativamente la mortalidad y mejora el rendimiento [6 ]. Estas células inmunitarias incluyen células B [7], así como diferentes subconjuntos de células T: CD4, CD8 y, principalmente, células T receptoras de células T (TCR)-δ [8].

Estos subconjuntos de células T se pueden distinguir más en función de su etapa de diferenciación y patrón de búsqueda. En los cerdos, la cadena CD8 se utiliza para diferenciar las células T CD8 − naïve de las CD8 más experimentadas con antígeno o las células T CD4 de memoria [9–11]. La expresión del receptor de quimiocinas (CCR) 7 distingue aún más el CCR7 más el alojamiento en ganglios linfáticos de los linfocitos T CCR7 que se alojan en tejidos periféricos [12]. Con un análisis combinado de CD8/CCR7, podemos distinguir múltiples subconjuntos de células T diferentes: CD8 −CCR7 más células T CD4 vírgenes, CD8 más CCR7 más células T CD4 de memoria central (TCM) y CD8 más CCR7− memoria efectora (TEM ) células T CD4; CCR7- de alojamiento de tejido periférico y CCR7 de alojamiento de ganglios linfáticos más células T CD8, y CD8 −CCR7−, CD8 más CCR7− y CD8 más CCR7 más TCR-δ células T.
Si bien informamos anteriormente que las células T TCR-δ porcinas poseen un patrón de búsqueda inverso en comparación con sus contrapartes TCR-, el papel específico de estos diferentes subconjuntos aún no se ha descrito [13]. Tanto los subconjuntos de células inmunitarias como los anticuerpos se transfieren a la descendencia para protegerlos contra diversos patógenos [4,5].

Durante décadas, el patógeno más desastroso para los cerdos ha sido el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV, [14,15]). Existen dos tipos principales de PRRSV: tipo 1 y 2 (PRRSV-1 y 2); su alta diversidad y capacidades inmunosupresoras hacen que el PRRSV sea una enfermedad problemática, lo que genera enormes pérdidas económicas para la industria porcina [16] y, hasta el momento, aunque las vacunas brindan protección parcial contra el PRRSV, no han podido controlar completamente esta enfermedad.

Hay dos tipos principales de vacunas disponibles para proteger contra PRRSV: vacunas de virus vivos modificados (MLV) y vacunas inactivadas, principalmente vacunas autógenas inactivadas (AIV); sin embargo, ambos tipos enfrentan sus desafíos.

El largo tiempo para desarrollar las vacunas MLV muy inmunogénicas significa que, por lo general, son más heterólogas con respecto a las cepas de PRRSV predominantes en las granjas, y aunque los AIV están dirigidos contra estas cepas predominantes en las granjas, su naturaleza inactivada las hace generalmente menos inmunogénicas.

Estos desafíos conducen a una falta de protección, especialmente en cerdos jóvenes, que puede atribuirse a tres factores: primero, la alta tasa de mutación de PRRSV limita la protección heteróloga, por lo que reduce la eficacia de la vacuna MLV; en segundo lugar, su capacidad inmunosupresora limita las vacunas más débiles (p. ej., AIV) y su retraso en la inducción de una respuesta inmunitaria protectora deja a los cerdos jóvenes especialmente susceptibles [17]; y tercero, nuestra comprensión de la respuesta inmune al PRRSV, especialmente en lechones, es limitada. Loving y Lunney produjeron una buena revisión sobre la comprensión general de la respuesta inmune al PRRSV [18,19].

Basándose principalmente en el tiempo prolongado para establecer la inmunidad inducida por la vacuna frente al PRRSV, los criadores de cerdos a menudo vacunan a las cerdas nulíparas y cerdas para permitir la transferencia de la inmunidad a los lechones. La investigación sobre la vacunación materna utilizando una MLV comercial contra el tipo PRRSV-1 no impidió la vacunación de lechones de 2 o 3-semanas de edad y protegió parcialmente a los lechones contra el desafío heterólogo [20]. Esta estrategia de vacunación también indujo células secretoras de IgG, IgA e interferón (IFN) específicas de PRRSV-1-en el calostro y la leche de las cerdas vacunadas. Estas células productoras de IFN son muy importantes en las respuestas antivirales, incluso en PRRSV [19,21].
Esta vacunación también indujo IgG sérica anti-PRRSV, que fue detectable después de las seis semanas de edad para los lechones no vacunados y permaneció estable en los lechones vacunados antes del desafío; sin embargo, las células secretoras de IFN no pudieron distinguirse de los niveles de fondo en lechones antes del destete [22]. Si bien el uso de MLV es un estándar de la industria, un régimen de vacunación combinado de una vacuna de refuerzo con MLV y AIV parece prometedor para superar cada una de las desventajas del uso independiente de MLV y AIV.

Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue determinar no solo si, sino también cómo, la vacunación materna con dos AIV diferentes (tratamiento (TRT) 1 más 2) puede impulsar una vacunación MLV estándar de la industria sola (TRT 0 ), para proteger mejor a la descendencia del desafío temprano de PRRSV2. Con este fin, estudiamos la respuesta inmunitaria humoral y mediada por células (CMI) inducida por la vacuna en estas primerizas y desafiamos a los destetados tempranos de primerizas dentro de cada uno de estos grupos a las 2 semanas de edad. Se siguió la respuesta inmunitaria local y sistémica de estos lechones durante 2 a 4 semanas.

Mostramos que la vacunación de refuerzo con AIV podría mejorar la protección de los lechones contra el PRRSV a las 2 semanas de edad y también identificamos los mecanismos inmunológicos subyacentes y caracterizamos la respuesta humoral y CMI anti-PRRSV en estos cerdos jóvenes. Además, detectamos dos nuevos tipos de células en cerdos: (1) células T CD8 −CCR7− CD4 que contribuyen en gran medida a la producción de IFN- en el lavado broncoalveolar (BAL): células TEMRA CD4 potenciales, y (2) una fuente importante de la respuesta anti-PRRSV especialmente en lechones—células B productoras de IFN.

2. Materiales y métodos

2.1. Diseño del estudio, animales y procesamiento de muestras

El propósito de este estudio fue evaluar el efecto de diferentes series de vacunación materna contra PRRSV2 sobre la inmunidad protectora en lechones destetados contra PRRSV-2. Antes del estudio, dos empresas independientes de ciencias biológicas aislaron y propagaron una cepa circulante de PRRSV-2 (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés), 1-7-4) de una empresa porcina de Carolina del Norte; produjeron dos vacunas autógenas distintas. Ambas vacunas contenían diferentes componentes patentados, pero contenían la misma cepa 1-7-4PRRSV-2 inactivada. El diseño de este estudio se ilustra en la Figura 1.

Ambas vacunas se administraron por vía intramuscular en una serie de cuatro dosis antes del parto: según el programa de vacunación corporativo de la compañía porcina de Carolina del Norte, 46 PRRSV-2 primerizas negativas en una granja comercial de cerdas fueron vacunadas con la vacuna Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Alemania) nueve semanas antes de la reproducción. Para mantener una terminología uniforme a lo largo de este estudio, las cerdas inscritas sexualmente maduras (aquí definidas como primerizas) se denominarán primerizas incluso después de haber sido inseminadas y paridas (comúnmente denominadas cerdas). Cuatro semanas antes del servicio, se recolectaron muestras de sangre de todas las primerizas para obtener suero y luego las primerizas se distribuyeron en tres tratamientos: TRT 0 (solo vacunación MLV); TRT 1 (vacunación MLV más 4 dosis de vacuna autógena (1-7-4) inactivada 1); o TRT 2 (vacunación MLV más 4 dosis de vacuna autógena (1-7-4) inactivada 2).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) y el título más alto de neutralización de foco fluorescente (FFN) en suero (criterio inmunitario primario) y la respuesta IFN de células T CD4 más alta (criterio inmunitario secundario) contra la cepa de desafío AIV dentro de su grupo. Para TRT 1 más 2, estos títulos de FFN oscilaron entre 1:4 y 1:128. Dado que TRT {{10}} no tenía ningún título contra la cepa AIV, elegimos las primerizas con los títulos anti-MLV más altos; estos títulos variaron de 1:16 a 1:32. La respuesta de IFN- en todas las nulíparas seleccionadas osciló entre 0,09 y 0,21 por ciento del total de células T CD4.

Cada una de estas primerizas proporcionó cuatro lechones para el estudio de exposición. A las 2 semanas de edad (= 0 semanas después de la infección, wpi), los cuatro lechones con los pesos de camada promedio más altos se seleccionaron para el estudio de desafío y se transportaron a las instalaciones de alojamiento de nivel 2 de bioseguridad de la Universidad Estatal de Carolina del Norte ( NCSU) Recursos de animales de laboratorio (LAR) (Raleigh, Carolina del Norte). Aquí, fueron asignados aleatoriamente a uno de los seis corrales en la misma habitación; en cada corral se alojaron dos cerdos por tratamiento (uno por primeriza). En resumen, hubo un total de 36 lechones en el estudio con 12 lechones por grupo de tratamiento.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106° F) y falta de respuesta a la estimulación física. Este cerdo se incluyó en todos los análisis hasta la semana 3 y se evaluó la patología de sus pulmones. No se realizó ningún análisis de citometría de flujo (FCM) para este animal en la necropsia.

Un día después del destete y la llegada a NCSU, todos los lechones fueron inoculados por vía intranasal con 1 × 105,5 PRRSV-2 partículas virales (cepa autógena 1-7-4) en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS, Corning, Corning, NY, EE. UU.) (500 µL/fosa nasal), se mantuvieron en posición supina durante 30 segundos y regresaron a sus corrales. La mitad de los animales se sacrificaron a los 2 dpi y los animales restantes se sacrificaron a los 4 dpi. En la necropsia, el LBA, los pulmones y los ganglios linfáticos traqueobronquiales (LN TrBr) se recolectaron y procesaron como se describió anteriormente [13].

El muestreo se realizó antes de la inoculación (0 wpi) y luego semanalmente, como se muestra en la Figura 1. El suero se recolectó en tubos de tubos separadores de suero (SST) (Becton Dickinson (BD) Biosciences, San José, CA, EE. UU.), y la sangre para el aislamiento de PBMC se recogió en tubos de heparina (BD Biosciences). El alojamiento de animales fue por la guía de los Institutos Nacionales de Salud para animales de investigación. Los lechones tenían acceso ilimitado al agua, se les alimentó con una dieta de destete de transición, luego con una dieta regular dos veces al día y se mantuvieron a 83 ◦F con un ciclo de luz/oscuridad de 12- horas. Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (IACUC) ID# 17-166A (29 de noviembre de 2017).

2.2. Propagación, titulación y evaluación de virus

El aislado viral de PRRSV-2 (cepa, 1-7-4) se propagó en macrófagos alveolares porcinos (PAM) negativos para PRRSV en RPMI-1640, 1x con L-glutamina (Corning, Corning, NY , EE. UU.) complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (VWR, Radnor, PA, EE. UU.) y antibiótico-antimicótico 1X (Corning) (denominado RPMI-completo) durante aproximadamente 30 h en matraces T-75 (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) hasta observar un efecto citopático. Los matraces se congelaron-descongelaron una vez y el sobrenadante se centrifugó a 2200 g a 4 ◦C durante 10 min. Para concentrar el virus, el sobrenadante se transfirió luego a tubos de centrífuga Nalgene de 36 ml (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EE. UU.) y se centrifugó en una ultracentrífuga Sorvall 100S (Sorvall, Thermo Fisher Scientific), Newtown, CT, EE. UU.) a 73 ,000 g a 4 ◦C durante 2 h.

Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en medio (RPMI completo) y se almacenó en alícuotas de 100 µL a -80 ◦C. Los títulos de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50 (TCID50) de las soluciones madre virales se determinaron utilizando PAM como se describió anteriormente (método Spearman-Karber TCID50 de acuerdo con el manual de pruebas de diagnóstico de la OIE [Organización Mundial de Sanidad Animal, anteriormente la Oficina Internacional de Epizootias (OIE ), “Capítulo 2.8.7 Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino”, Terr. Man., No. Mayo 2015, 2015].

2.3. viremia

El suero aislado fue analizado por el laboratorio de diagnóstico de la empresa porcina de Carolina del Norte mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT qPCR) con un kit de ARN/ADN de patógenos 5X MagMAX (Thermo Fisher Scientific) y un kit VetMAX PRRSV qPCR (Thermo Fisher Scientific). El suero de nulíparas vacunadas fue negativo para PRRSV (qPCR) en el momento del parto según lo determinado por el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa (ISU VDL, Ames, IA, EE. UU.). Los valores de ∆Ct se calcularon restando el valor de Ct de una muestra del valor de Ct considerado como PRRSV negativo (Ctneg=37) para PRRSV: ∆Ct=37 − Ctx.

2.4. Validación de anticuerpos neutralizantes y determinación de muestras positivas

Se enviaron muestras de suero de nulíparas y lechones al Laboratorio de Diagnóstico e Investigación Animal de la Universidad Estatal de Dakota del Sur (Brookings, SD) que completó la determinación de anticuerpos neutralizantes (NA) del PRRSV-2 utilizando FFN y la cepa de inoculación 1-7-4. Un resultado positivo es la dilución de suero más alta con una reducción del 90 por ciento o más en el número de unidades formadoras de focos fluorescentes [23].

2.5. Procedimientos de necropsia, puntuación y aislamientos de células de tejido

En la necropsia (2 o 4 wpi), los animales se sacrificaron usando una inyección intravenosa letal de Euthasol (Covetrus, MW, 390 mg/ml de pentobarbital, 50 mg de fenitoína/ml). Luego, se recolectaron los pulmones, el timo y los LN de TrBr.

Para los pulmones se tomaron fotografías dorsales y ventrales; los pulmones se lavaron con PBS 1x para recolectar el lavado alveolar bronquial (BAL) y se tomaron cinco muestras totales para histología: una de cada uno de los lóbulos caudales derecho e izquierdo, lóbulos medios derecho e izquierdo y luego una del lóbulo accesorio. Las muestras histológicas se fijaron en fijador de formaldehído/Zn (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) durante 24 h, se transfirieron a etanol al 70 % y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Los portaobjetos teñidos (histología) y las fotografías de los pulmones (patología macroscópica) se enviaron a ISU VDL y un patólogo de diagnóstico veterinario desconocía los tratamientos y las fechas de la necropsia; La lesión pulmonar y la puntuación de neumonía intersticial se realizaron como se describió previamente [24].

Se evaluaron vistas dorsales y ventrales de fotografías de pulmones para determinar el porcentaje de pulmón afectado con neumonía. Específicamente, el porcentaje de neumonía se estimó visualmente para cada lóbulo pulmonar y el porcentaje total para todo el pulmón se calculó en función de la proporción ponderada de cada lóbulo en relación con el volumen pulmonar total. Cada uno de los cuatro lóbulos craneoventrales representó el 10 por ciento, el lóbulo accesorio el 5 por ciento y cada uno de los dos lóbulos caudales representó el 27,5 por ciento del pulmón total.

Las secciones de histopatología pulmonar se examinaron a ciegas en busca de lesiones microscópicas y a cada lóbulo se le asignó una puntuación estimada basada en la gravedad de la neumonía intersticial de la siguiente manera: 0=sin lesiones microscópicas; 1=neumonía intersticial mínima; 2=neumonía intersticial leve; 3=neumonía intersticial moderada; 4=neumonía intersticial abundante; 5=neumonía intersticial multifocal grave; 6=neumonía intersticial difusa grave. Para todos los tejidos recolectados (pulmones, timo y TrBr LN), el tejido se cortó en pedazos pequeños y se presionó a través de filtros de drenaje redondos de acero inoxidable (Grainger, Lake Forest, IL, EE. UU.) en tubos de 50 ml con PBS helado para eluir. suspensiones unicelulares. Los grumos fibrosos se filtraron con filtros de 40 µm (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.).

2.6. Aislamiento de sangre periférica, estimulación viral y tinción/análisis de IFN-FCM

El aislamiento de PBMC se realizó mediante centrifugación de densidad Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y tubos SepMate-50 ml (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá) según el protocolo del fabricante. Los recuentos de células en suspensión de células individuales y PBMC se completaron en un sistema de recuento de células CASY (Schärfe System, ahora: Roche Innovatis AG, Bielefeld, Alemania). Para el ensayo de producción de IFN, se sembraron 5 × 105 PBMC y linfocitos de los pulmones, y TrBr LN en ocho repeticiones en una placa 96-bien de fondo redondo (Corning) en 100 µl de RPMI completo y se dejó reposar durante la noche en un incubadora a 37 ◦ C y 5 por ciento de CO2. A la mañana siguiente, se añadieron a cada pocillo 100 µl de RPMI-completo que contenía la cepa de PRRSV 1-7-4 (multiplicidad de infección, MOI=0.1); las placas se devolvieron a la incubadora durante 24 h de estimulación viral.

Durante las últimas 4 h de cultivo, se añadió monensina (5 µg/mL, Alfa Aesar, Haverhill, MA, EE. UU.) para bloquear la liberación de IFN- de las células. Al finalizar la incubación de 24 h, las réplicas se agruparon y se tiñeron como se indica en la Tabla 1; en promedio, se registraron 276 756 linfocitos vivos únicos (SLL) en un Cytoflex utilizando el software CytExpert (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.). El análisis de datos se realizó con FlowJo versión 10.6.1 (FLOWJO LLC). La jerarquía de activación para el análisis de la respuesta de IFN- se muestra en las Figuras 4 y 5 para PBMC y en la Figura complementaria S1 y la Figura 7 para BAL, tejido pulmonar y TrBr LN.

2.7. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con Graphpad Prism 8 (Graphpad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Los datos con un conjunto de datos completo se analizaron mediante ANOVA bidireccional (durante todo el estudio) o unidireccional (en la necropsia). Los datos con puntos de datos faltantes (principalmente debido a la necropsia del 50 % de los cerdos a 2 ppp) se analizaron mediante un modelo de efectos mixtos (máxima verosimilitud restringida, REML). Todas las comparaciones múltiples se realizaron con la prueba de comparación múltiple de Dunnett. La ilustración de los datos se realizó mediante diagramas de violín que muestran la distribución, los puntos individuales, la mediana (según corresponda, línea negra discontinua) y los intervalos 25/75 (según corresponda, línea de color). Los análisis de correlación entre los niveles de nAb de primerizas y lechones se realizaron utilizando los coeficientes de correlación de Pearson y un intervalo de confianza del 95 por ciento de dos colas.

3. Resultados

3.1. Diseño del estudio y eficacia de la vacuna: signos clínicos, viremia, aumento de peso y patología pulmonar

El estudio se realizó como se muestra en la Figura 1. Tras la inoculación de PRRSV, los cerdos mostraron síntomas leves de PRRSV que comenzaron dentro de los 3 o 4 días posteriores a la infección: fiebre [principalmente a 1 wpi, dns], letargo, reducción del consumo de alimentos, tos/estornudos leves. No se observaron diferencias significativas para estos síntomas y persistieron en diversos grados hasta la necropsia. La figura 2 ilustra la viremia, las ganancias de peso corporal semanales, así como las puntuaciones brutas y de histopatología.

Como se muestra en la Figura 2A, todos los cerdos eran PRRSV-2 negativos al destete y la inoculación intranasal con PRRSV-2 indujo una viremia que alcanzó su punto máximo a las 2 wpi. Si bien no hubo diferencia en la viremia entre TRT 0 y TRT 2, TRT 1 tuvo una viremia significativamente menor en las dos primeras semanas que el grupo de control TRT 0. Las ganancias de peso de los cerdos en todos los grupos fueron muy similares durante las tres primeras semanas; sin embargo, al final del estudio, y en comparación con TRT 0, TRT 2 y TRT 1 tuvieron ganancias de peso semanales significativamente más altas (Figura 2B). En particular, mientras que la patología pulmonar generalmente se resuelve en la infección por PRRSV y, por lo tanto, fue similar entre los grupos a los 4 dpi (dns), ambas vacunas AIV maternas, por lo que TRT 1 más 2, redujeron significativamente la patología pulmonar a las 2 wpi: ambas redujeron los niveles porcentuales de lesiones macroscópicas y/o neumonía intersticial (Figura 2C, D). La prevalencia de lesiones pulmonares macroscópicas en los pulmones de TRT 0 fue entre 20–70 por ciento; en contraste, la mayoría de los cerdos en TRT 1 más 2 tenían una prevalencia de lesiones pulmonares por debajo del 20 por ciento—Figura 2C. De manera similar, mientras que la mediana de la puntuación histopatológica para la neumonía intersticial en los pulmones de los cerdos TRT 0 fue de tres, fue de 1,8 para TRT 1 y 1,2 para TRT 2, respectivamente. Comparado con TRT 0, esto demuestra una tendencia hacia la significancia (p=0.07) y una disminución significativa en la histopatología pulmonar en cerdos de primerizas vacunadas con AIV—Figura 2D. Estos datos demuestran que la vacunación AIV puede reducir significativamente la viremia y la patología pulmonar, además, también muestran que la vacunación materna AIV contra PRRSV-2 puede aumentar la inmunidad de los lechones de 2-semanas de edad.

3.2. Inducción de anticuerpos neutralizantes maternos y su transferencia a los lechones

Se analizó la inducción de la respuesta inmunitaria humoral en primerizas y sus crías determinando los títulos de NA FFN (Figura 3).

Vacunación de todos los grupos con los títulos de NA inducidos por MLV en primerizas de entre cuatro y 64 sin diferencias significativas entre los tres grupos (dns). Por el contrario, mientras que la vacunación MLV sola (TRT 0) no incluía NA contra la cepa heteróloga 1-7-4, ambas vacunas de refuerzo de AIV indujeron títulos de NA de hasta 1:16 (para TRT 2) e incluso 1 :128 (para TRT 1)—Figura 3A.

Estos NA séricos se transfirieron por vía materna a los lechones (Figura 3B): mientras que los lechones TRT 0 no mostraron títulos de NA en 0 wpi, los lechones TRT 1 y TRT 2 poseían NA séricos para la cepa 1-7-4 antes infección que se correlacionó directamente con los niveles maternos de NA (Figura 3C, r=0.886, p < 0.0001). Estos títulos de NA disminuyeron durante las primeras dos semanas, antes de estabilizarse a las 4 wpi. Sin embargo, en comparación con TRT 0, los lechones de primerizas vacunadas con AIV (TRT 1 más 2) tenían títulos séricos de NA significativamente más altos ya antes del desafío y estos títulos aumentados duraron hasta 2-3 wpi, es decir, hasta 4-5 semanas de edad—Figura 3B.

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