Métodos para generar y evaluar modelos de pez cebra de enfermedades renales humanas Parte 1

ABSTRACTO

Los trastornos relacionados con los riñones afectan a millones de personas en todo el mundo. Una encuesta de pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) mostró que la carga de enfermedades renales aumenta cada año. El estudio de la carga global de enfermedad (GBD) de 2017 clasificó a la ERC como la 12.ª causa de muerte en todo el mundo. Por lo tanto, la identificación de las causas de las enfermedades renales, el desarrollo de métodos de diagnóstico precisos y nuevas terapias son muy relevantes. Los organismos modelo que recapitulan fielmente las enfermedades humanas juegan un papel importante en la comprensión del proceso de la enfermedad y proporcionan un terreno valioso para encontrar su cura. El pez cebra es un modelo excelente para estudiar el desarrollo, la fisiopatología y los aspectos moleculares de las enfermedades renales humanas. En esta revisión, resumimos varias manipulaciones genéticas y experimentales que se pueden llevar a cabo en el pez cebra para comprender mejor la fisiopatología de las enfermedades renales humanas. Sugerimos que estos métodos serán útiles en el desarrollo de terapias potenciales para tratar enfermedades renales.

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PALABRAS CLAVE:CKD, AKI, un modelo de pez cebra de enfermedades renales humanas, pronefros, patología renal

Introducción

El riñón es uno de los órganos vitales de los vertebrados que elimina los productos de desecho y mantiene las concentraciones de pH, iones y metabolitos de la sangre dentro del rango fisiológico. El riñón secreta eritropoyetina que regula la producción de glóbulos rojos y activa la vitamina D que ayuda a los huesos a absorber el calcio. Hay alrededor de un millón de nefronas en cada riñón humano, que son las unidades estructurales y funcionales de este órgano. En consecuencia, los defectos en las nefronas afectan la estructura y las funciones de los riñones. La disfunción del riñón puede ocurrir debido a mutaciones genéticas, infecciones, lesiones, medicamentos o exposición a compuestos tóxicos en el medio ambiente. Las enfermedades crónicas como la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y la hipertensión son los principales contribuyentes a la carga de enfermedades renales (Levey et al., 2010). La función renal deteriorada también aumenta el riesgo de complicaciones en otros sistemas de órganos (Thomas et al., 2008). Los tipos comunes de enfermedades renales y sus causas se describen en la Tabla 1.

Enfermedades renales

Las enfermedades renales contribuyen a una fracción significativa de la carga de morbilidad a nivel mundial. Alrededor de 750 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por trastornos relacionados con los riñones (Crews et al., 2019). La ERC es más común entre ellos, con una prevalencia mundial del 13,4 % (Hill et al., 2016). El estudio GBD de 2010 clasificó a la ERC como la 18.ª causa de muerte en todo el mundo, que saltó al 12.º en 2017 por causar la mayor cantidad de muertes a nivel mundial (Jha et al., 2013; Carney, 2020). Según el estudio GBD en 2017, se informaron alrededor de 697,5 millones de casos de ERC en todo el mundo, entre los cuales murieron 1,2 millones de personas. Se estima que el número de muertes por ERC aumentará a 4 millones para 2040 en el peor de los casos (Foreman et al., 2018). Un tercio de los pacientes con ERC viven en dos países, China e India (Bikbov et al., 2020). El estado de la ERC entre la población india no está claro debido a la falta de sistemas precisos de recopilación de datos. En India se informaron alrededor de 115 millones de casos de ERC en 2017 (Bikbov et al., 2020). Las enfermedades más comunes en la población india son la diabetes y la hipertensión (Geldsetzer et al., 2018). Según el informe del Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR), la prevalencia de diabetes e hipertensión entre la población adulta urbana es del 28 % y el 21,4 %, respectivamente (Varma, 2015). Entre el 40 y el 60 por ciento de los casos de ERC ocurren debido a estas complicaciones y su número aumenta rápidamente (Rajapurkar et al., 2012). El centro de datos sobre enfermedades renales de la Sociedad Internacional de Nefrología informó una prevalencia de CDK del 16,8 % entre la población india (Ene-Iordache et al., 2016). Las causas de la ERC varían en toda la India. Andhra Pradesh, Odisha y Goa informaron altos niveles de ERC de una etiología desconocida conocida como nefropatía intersticial crónica (Varughese y Abraham, 2018). Dado que el número de pacientes con ERC está aumentando en todo el mundo a un ritmo alarmante, existe una necesidad urgente de llevar a cabo un análisis exhaustivo de las causas fundamentales de las enfermedades renales comunes para encontrar mejores formas de prevenirlas y curarlas. Los organismos modelo que pueden imitar la fisiología humana y las condiciones de enfermedad pueden proporcionar excelentes vías para abordar los problemas anteriores. El pez cebra se ha convertido en un modelo útil para estudiar el desarrollo y las enfermedades y proporciona formas prometedoras para identificar nuevos objetivos terapéuticos y fármacos. En esta revisión, hemos discutido varios métodos para recapitular las enfermedades renales humanas en el pez cebra y cómo estos modelos pueden usarse para comprender la patogenicidad de la enfermedad y sus mecanismos moleculares subyacentes. Esto puede resultar en la generación de nuevos enfoques terapéuticos para el manejo y cura de enfermedades renales.

Similitudes entre el riñón humano y el del pez cebra

El desarrollo de los riñones en los mamíferos es único, ya que tiene lugar a través de tres estructuras distintas durante la embriogénesis: pronefros, mesonefros y metanefros. Las dos primeras estructuras son transitorias en los mamíferos y solo el metanefros persiste durante toda la vida (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Pronephros es el riñón funcional durante el desarrollo embrionario en vertebrados inferiores como anfibios y peces, que es reemplazado por mesonephros como riñón funcional en etapas posteriores (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). La Tabla 2 describe el tiempo de duración de las diferentes formas de riñón en humanos, ratones, Xenopus y pez cebra.

Aunque la complejidad global del riñón aumenta a medida que avanzamos hacia las formas superiores, las nefronas son las unidades estructurales y funcionales de todos los tipos de riñones. Cada nefrona tiene tres partes: corpúsculo renal para filtrar la sangre, túbulo para absorber y secretar solutos y conducto colector para recolectar desechos no deseados para su excreción. El epitelio tubular se modela en diferentes segmentos para llevar a cabo funciones específicas. Las nefronas de todas las formas de riñón poseen un patrón de segmentación similar (Desgrange y Cereghini, 2015). La organización segmentaria de la nefrona del pronefros y mesonefros del pez cebra es similar a la del metanefros de los mamíferos, como se muestra en la Fig. 1. El túbulo pronéfrico del pez cebra se divide en túbulo contorneado proximal (PCT), túbulo recto proximal (PST) y túbulo temprano distal (DE ) y túbulos distales tardíos (DL), que son análogos al patrón de segmentación de las nefronas metanéfricas de los mamíferos. El pez cebra tiene una glándula endocrina llamada corpúsculos de Stannius (CS), que mantiene la homeostasis del calcio (Krishnamurthy, 1976). El CS está formado por la transdiferenciación de las células epiteliales renales entre los segmentos DE y DL, que se separan gradualmente del túbulo y forman la glándula CS emparejada que se ubica retroperitonealmente en la superficie del riñón en peces adultos (Roberts y Ellis, 2012; Naylor et al., 2018). Una de las principales diferencias entre las nefronas de pez cebra y de mamíferos es la falta de asa de Henle en el pez cebra, que actúa como un multiplicador de contracorriente para generar un gradiente osmótico medular para la conservación del agua. Este segmento no tiene ninguna utilidad en el pez cebra por ser un pez de agua dulce (Elmonem et al., 2018). Cada segmento posee distintos tipos de células y expresiones génicas específicas del segmento, que se conservan entre los vertebrados (Verlander, 1998; Desgrange y Cereghini, 2015). Todos los tipos de riñón siguen vías similares de desarrollo. Las siguientes cuatro etapas están involucradas sucesivamente en el desarrollo de las nefronas; A: inducción del mesodermo intermedio para formar el primordio renal, B: epitelización y crecimiento del conducto renal, C: patrón de la nefrona en segmentos especializados y D: vascularización de la nefrona para la filtración de sangre (Drummond, 2003).

Métodos para generar modelos de pez cebra de enfermedades renales humanas

El pez cebra posee un par de pronefros que comienzan a formarse después de 12 horas posteriores a la fertilización (hpf) y se vuelven completamente funcionales a las 48 hpf. La disponibilidad de la secuencia del genoma completo, el 71 por ciento de los genes humanos que tienen al menos un ortólogo de pez cebra, la facilidad de manejo, los embriones transparentes, el corto tiempo de generación, las técnicas eficientes de manipulación de genes, los métodos para la generación de peces transgénicos y su detección rápida hacen del pez cebra el organismo modelo más adecuado para estudiar anomalías renales (Howe et al., 2013; Poureetezadi y Wingert, 2016). Una de las características cruciales del pez cebra adulto es su capacidad para regenerar nuevas nefronas mediante el proceso de neo-nefrogénesis en respuesta a una lesión renal (Chambers y Wingert, 2016). La Tabla 3 describe las comparaciones entre el pez cebra y otros organismos modelo comunes como ratones y Xenopus. Las manipulaciones genéticas en el pez cebra han demostrado que los nuevos componentes genéticos del desarrollo y la función renal pueden identificarse mediante el uso de este organismo modelo (Poureetezadi y Wingert, 2016). Existen varios métodos para generar modelos de pez cebra de enfermedades renales humanas.

genética avanzada

La pantalla de genética directa se usa para identificar genes que están asociados con fenotipos de interés (Lawson y Wolfe, 2011). Tanto la mutagénesis química como la insercional se utilizan en las pantallas genéticas directas (Patton y Zon, 2001). La mutagénesis química es un cribado basado en tres generaciones en el que se trata a machos adultos con mutágenos químicos como etil metanosulfonato (EMS), etil nitrosourea (ENU) o mutágenos físicos como la radiación gamma para generar varias mutaciones en las células germinales (Varshney y Burgess, 2014). Los peces portadores de mutaciones luego se cruzan con hembras de tipo salvaje para generar peces F1 que contienen alelos únicos de la mutación generada. Los peces F1 se cruzan para generar portadores F2 que luego se cruzan para obtener sus mutantes homocigóticos en la generación F3. La descendencia que tiene los fenotipos deseados luego se aísla y se usa para mapeo genético y secuenciación para identificar el gen mutado (Patton y Zon, 2001). Otras variaciones de esta pantalla, como el uso de diploides haploides y homocigóticos, pueden ayudar a reducir el tiempo y el esfuerzo necesarios para identificar el fenotipo y la mutación genética causante (discutido en detalle por Patton y Zon, 2001). Las líneas indicadoras transgénicas que expresan proteínas fluorescentes en el órgano de interés se pueden combinar con el cribado genético directo convencional para cribar fácilmente los mutantes de interés. Una pantalla de mutagénesis basada en ENU condujo a la identificación del pez cebra mutante bombilla (lib) que muestra defectos morfológicos y de segmentación de nefronas similares a los embriones de pez cebra deficientes en ácido retinoico (AR). Se encontró que los mutantes lib tienen una transición de C a A en el nucleótido 174 de aldh1a2, que se prevé que sintetice una proteína truncada de 58 aminoácidos de longitud, anulando así la función de aldh1a2 y afectando la síntesis de RA a partir de retinaldehído. El análisis del mutante lib, sin cuello (nls) que tiene una mutación puntual en el dominio catalítico de aldh1a2 y embriones tratados con DEAB (inhibidor de la síntesis del ácido retinoico) reveló que los niveles de RA modulan la segmentación de la nefrona al cambiar la expresión espacial de los factores de transcripción específicos de los segmentos (Wingert y Davidson, 2011; Begemann et al., 2001; Mullins et al., 1994). Otro mutante llamado Zeppelin ayudó a identificar brac2 como regulador del desarrollo de podocitos (Kroeger et al., 2017).

La mutagénesis por inserción es un método basado en transposones o antivirus que se utiliza para insertar ADN aleatoriamente en diferentes loci genómicos, y este ADN extraño ayuda a identificar el gen mutado (Amsterdam et al., 1999). El Laboratorio Hopkins del MIT realizó una prueba de mutagénesis por inserción en embriones de pez cebra utilizando un vector retroviral. Identificaron 12 genes que estaban asociados con fenotipos renales defectuosos que mostraban quistes en la región tubular glomerular, entre los cuales cuatro estaban relacionados con la formación de cilios (Sun et al., 2004). Los inconvenientes del enfoque de la genética avanzada son que el proceso de selección es engorroso y requiere mucho tiempo. Sin embargo, los avances en la nueva tecnología de secuenciación han hecho que el enfoque de la genética avanzada sea mucho más eficiente.

Eliminación de genes utilizando nucleasas programables

Una de las principales ventajas de utilizar el pez cebra como organismo modelo es la disponibilidad de técnicas eficientes de edición del genoma, como CRISPR/Cas, TALEN y ZFN (Sertori et al., 2016). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9 es la tecnología de edición del genoma más versátil y de uso común en el pez cebra. Se diseña una quimera de ARN CRISPR (ARNcr) y ARNcr activador trans (ARNtracr) como un ARN guía único (ARNsg), que junto con la proteína Cas9/ARNm se inyectan en embriones de pez cebra en la etapa de una célula (Varshney et al. , 2016). El sgRNA se une a la secuencia de ADN objetivo de 20 pb adyacente a una secuencia NGG de motivo adyacente protoespaciador (PAM) en el genoma, luego Cas9 genera un corte de doble cadena en la secuencia de ADN objetivo. Luego, esto se repara preferiblemente mediante la unión de extremos no homólogos, que es un mecanismo de reparación propenso a errores que da como resultado la generación de inserción/eliminación aleatoria (indel) que conduce a cambios en el marco de lectura de la secuencia de codificación y, en consecuencia, anula la funciones del gen de interés. En los últimos años se han desarrollado metodologías avanzadas para aumentar la eficacia de la técnica de edición del genoma basada en CRISPR (Liu et al., 2019). Es posible eliminar un gran fragmento de ADN utilizando dos o más sgRNA a la vez (Kim y Zhang, 2020). También es posible apuntar simultáneamente a múltiples genes de manera eficiente en un solo embrión de pez cebra (Shah et al., 2016). Se han realizado muchos estudios para generar mutantes de pez cebra para recapitular las enfermedades renales humanas mediante el uso de la tecnología CRISPR/Cas9. La desactivación de la proteína de la membrana ciliar Arl13b mediada por CRISPR resultó en la generación de mutantes que imitan el "síndrome de Joubert" (Cantagrel et al., 2008). Se informa que las mutaciones en el gen ELMO1 humano contribuyen a la nefropatía diabética. El pez cebra mutante elmo1 exhibe fenotipos observados en embriones hiperglucémicos generados por la eliminación del gen pdx1, como glomérulos más grandes, podocitos defectuosos, cuello más corto e hiperfiltración, lo que destaca la función conservada de este gen (Sharma et al., 2016). El pez cebra mutante magi2a exhibe un síndrome nefrótico resistente a los esteroides que también se observa en personas con mutaciones en MAGI2 (Jobst-Schwan et al., 2019). Estas observaciones destacan la idoneidad del pez cebra como organismo para modelar enfermedades renales humanas.

Otro método para generar mutantes de pez cebra es Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) basado en la edición del genoma. En esta técnica, el dominio de unión al ADN TALE se compone de monómeros, cada monómero consta de repeticiones en tándem de 34 residuos de aminoácidos que se unen a un nucleótido particular en la secuencia de ADN. Estas secuencias TALE se derivan de la bacteria patógena Xanthomonas que altera la transcripción de genes en las células huésped (Boch y Bonas, 2010). La construcción de direccionamiento de TALEN consta de una señal de localización nuclear, el dominio de unión al ADN y el dominio de nucleasa FokI en sus terminales carboxilo. TALEN funciona en pares con sus sitios de unión ubicados en hebras opuestas de ADN separadas por una secuencia espaciadora de 12 a 25 pb. Las construcciones se unen al sitio objetivo en el núcleo y generan una ruptura de doble cadena, que luego se repara mediante una unión de extremos no homólogos (Liu et al., 2014). El pez cebra mutante generado por CRISPR o TALEN puede activar genes que compensan la pérdida de genes de interés, lo que dificulta descubrir la función del gen (Rossi et al., 2015). Sin embargo, es posible identificar estos genes compensatorios mediante el análisis del transcriptoma utilizando métodos de secuenciación de próxima generación (NGS), que pueden ayudar a identificar la función del gen de interés. La identificación de genes y vías moleculares que compensen la pérdida de función de un gen puede ayudar a encontrar nuevos métodos de tratamiento para mutaciones genéticas que causan enfermedades graves (El-Brolosy y Stainier, 2017).

Eliminación de genes usando oligos antisentido de morfolino

Los morfolinos son oligonucleótidos no aniónicos que son relativamente estables en comparación con sus oligómeros de ADN o ARN (Summerton, 1999). Los oligonucleótidos antisentido de morfolino se unen al ARNm de una proteína diana en su sitio de iniciación de la traducción y bloquean su traducción. Otro tipo de oligos antisentido de morfolino puede dirigirse a uniones de empalme y bloquear el empalme de pre-ARNm (Summerton, 1999). El efecto de morfolino-oligo antisentido es transitorio y se puede utilizar para estudiar el papel de desarrollo temprano de los genes de interés. La inyección de morfolino-oligo antisentido se realiza en la etapa celular 1-4 de los embriones de pez cebra y su efecto se puede ver hasta 3-5 días después de la fertilización (pdf) (Bill et al., 2009). Los oligonucleótidos antisentido de morfolino a menudo muestran efectos fuera del objetivo (Robu et al., 2007). Los experimentos de control, como un experimento de rescate, deben realizarse inyectando morfolino junto con ARNm que no puede ser el objetivo de este oligoantisentido para verificar su especificidad (Eisen y Smith, 2008). Se ha desarrollado un morfolino fotoactivado, cuya actividad puede controlarse espacial y temporalmente mediante la exposición a los rayos UV (Tallafuss et al., 2012). Se han llevado a cabo numerosos estudios utilizando la eliminación de genes mediada por oligoantisentido de morfolino para comprender las enfermedades renales humanas. Por ejemplo, la eliminación del gen de la nefrocistina-3 condujo a la formación de quistes e hidrocefalia en embriones de pez cebra de manera similar a la enfermedad de tipo nefronoptisis-3 (Zhou et al., 2010).

Los antibióticos aminoglucósidos generalmente utilizados para tratar muchas infecciones potencialmente mortales son conocidos por su efecto nefrotóxico y ototóxico (Mingeot-Leclercq y Tulkens, 1999). La gentamicina es un antibiótico de uso común que puede inducir lesión renal aguda (IRA) en el pez cebra. La gentamicina causa aplanamiento del epitelio del borde en cepillo, pérdida del epitelio tubular, deformación de la estructura del glomérulo, fosfolipidosis lisosomal y acumulación de leucocitos o restos celulares en la luz tubular, lo que simula una sobredosis de gentamicina en humanos (Cianciolo Cosentino et al., 2010). El pez cebra puede regenerar y reemplazar las nefronas dañadas. El insulto de gentamicina se puede utilizar para estudiar la regeneración renal en el pez cebra (Kamei et al., 2015). La lesión por gentamicina induce una respuesta de regeneración que desencadena que las células madre renales pasen por las etapas de especificación, proliferación y diferenciación para generar nuevas nefronas. Los peces adultos tardan entre 14 y 21 días en regenerar las nefronas (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). El cisplatino, que se utiliza como fármaco quimioterapéutico para tratar tumores, también tiene efectos nefrotóxicos, como se ha observado en el pez cebra (Hentschel et al., 2005). La etimicina es otro aminoglucósido que se puede usar mientras se imita la nefrotoxicidad y la ototoxicidad bajas en embriones de pez cebra (Shao et al., 2020). Por lo tanto, AKI y la regeneración renal se pueden estudiar en el pez cebra con la ayuda de estos antibióticos.

Lesión mecánica del riñón.

El pronefros del pez cebra puede lesionarse físicamente mediante resección, apuñalamiento o criolesión. La lesión quirúrgica se puede realizar usando pinzas finas para apuñalar el área deseada del pronefros para crear un modelo AKI. Esta técnica se usó para dañar el conducto pronéfrico cercano a la cloaca, lo que perjudicó el flujo de líquido y provocó la formación de quistes en 30 minutos (Kramer-Zucker, 2005). Se encontró que la reducción en la tasa de flujo de líquido en pronephros genera una contrapresión en el sitio de entrada de líquido, lo que provoca la expansión luminal del túbulo y la formación de quistes. Otro grupo de investigadores obstruyó el túbulo pronéfrico a 50 hpf o en los túbulos mesonéfricos de pez cebra de 12-meses de edad usando pinzas para pellizcar el área cerca de los túbulos colectores distales (Hellman et al., 2010). Descubrieron que la cicatrización de los túbulos conduce a un aumento en la tasa de latidos de los cilios y una regulación positiva del factor de transcripción foxj1a que regula la expresión del gen lipogénico. Esto sugiere que la lesión de los túbulos pronéfricos genera una señal mecanosensorial basada en los cilios para mantener la homeostasis de las nefronas.

Lesión renal inducida por láser

La ablación celular mediada por láser se utiliza como herramienta para estudiar la lesión renal e imitar la LRA en el pez cebra. Johnson et al., (2011) describieron un método para la ablación mediada por láser seguido del seguimiento de las nefronas en regeneración. Inyectaron dextrano-FITC de 40 kDa en los somitas del tronco de embriones de pez cebra a 48-55 hpf para marcar las células epiteliales del túbulo proximal, que luego se dirigieron a la ablación mediada por láser a las 72 hpf. Los embriones extirpados luego se reinyectaron con rodamina dextrano para rastrear las células epiteliales del túbulo proximal. Descubrieron que se formó un túbulo proximal completamente desarrollado el séptimo día después de la ablación mediada por láser (Johnson et al., 2011). Otra alternativa es utilizar una línea transgénica específica de riñón para identificar células para la ablación mediada por láser y monitorear los comportamientos de las células vecinas. Se utilizó una luz láser violeta de 405 nm de longitud de onda para apuntar al túbulo pronéfrico del pez cebra Tg(atp1a1a.4:GFP) (Palmyre et al., 2014). Como los espectros de excitación de GFP se encuentran en el rango de luz azul a violeta, absorbió la luz láser de 405 nm, que actúa como un sumidero de energía para inducir lesiones en las células epiteliales objetivo. Este experimento condujo al descubrimiento de que la migración celular es la respuesta principal del epitelio lesionado. La migración celular colectiva provocó un estiramiento mecánico que proporcionó estímulos para la proliferación celular para reparar el túbulo lesionado. Para determinar el momento en que el túbulo pronéfrico del pez cebra adquiere la capacidad de regeneración, Yakulov et al., (2018) utilizaron un 2-láser de fotones para extirpar una pequeña parte de los túbulos pronéfricos en Tg(cldn2b:lyn-GFP) embriones en diferentes momentos y siguieron el proceso de regeneración. Descubrieron que la ablación de los túbulos pronéfricos de 2-embriones de un día se reparaba rápidamente mediante respuestas migratorias, mientras que los embriones de 1-días no tenían esta capacidad. Llevaron a cabo perfiles de expresión génica de embriones de pez cebra lesionados y descubrieron que cxcr4b y mica están involucrados en este proceso de reparación (Yakulov et al., 2018).

genética química

Se pueden usar pequeñas moléculas bioactivas para interferir con la función de las proteínas y comprender su función biológica. Una gran cantidad de bibliotecas químicas están disponibles comercialmente o se pueden personalizar para sondear las funciones de las proteínas. Estas bibliotecas de moléculas pequeñas incluyen inhibidores de cinasas, inhibidores de proteasas, receptores nucleares y ligandos que se pueden usar para identificar el papel de las vías de señalización involucradas en el desarrollo y la función de los órganos (Kawasumi y Nghiem, 2007). En las últimas décadas, el pez cebra se ha convertido en un poderoso organismo vertebrado modelo para la detección química de alto rendimiento y la puntuación fenotípica (Kaufman et al., 2009). Cao et al., (2009) utilizaron el enfoque de detección química para identificar compuestos que pueden revertir los fenotipos causados ​​por mutaciones en pkd2 (gen causal de PKD) e ift172 (un gen responsable de la formación de cilios). Descubrieron que un inhibidor de pan-histona desacetilasa (pan-HDAC) tricostatina A (TSA) y un inhibidor de HDAC específico de clase I, ácido valproico (VPA), pueden suprimir la formación de quistes renales en el modelo knock-out de pkd2 (Cao et al., 2009 ). Por lo tanto, la genética química puede ser una herramienta útil para identificar nuevos candidatos a fármacos que pueden revertir o suprimir enfermedades.

Modelos de lesión renal genéticamente inducibles

Se puede utilizar un modelo de ablación de tejido genéticamente inducible en el pez cebra en el que la nitrorreductasa bacteriana (NTR) se expresa bajo el control de un promotor de elección que impulsa la expresión de NTR en un segmento particular de los pronefros. NTR convierte el metronidazol en un metabolito citotóxico que puede causar la muerte de las células que expresan NTR (Curado et al., 2008). Zhou y Hildebrandt (2012) utilizaron esta técnica para inducir lesiones en los podocitos al expresar NTR bajo el control del promotor de podocina en la línea de pez cebra Tg(pod: NTR-mCherry). También desarrollaron una línea transgénica doble de VDBP-GFP (proteína de unión a vitamina D etiquetada con GFP) como marcador de proteinuria junto con la línea Tg (pod: NTR-mCherry). El tratamiento con metronidazol provocó la lesión del podocito, lo que provocó edema en todo el cuerpo y acumulación de VDBP-GFP en los túbulos proximales, imitando el fenotipo del síndrome nefrótico humano (Zhou y Hildebrandt, 2012).

Métodos para evaluar el desarrollo y la función de los pronefros en el pez cebra

Hemos descrito los métodos para generar modelos de enfermedad renal humana mediante el uso de pez cebra. La creación de un modelo de enfermedad utilizando otro organismo es el paso inicial, que debe evaluarse por su capacidad para recapitular fielmente varios aspectos de una enfermedad observada en humanos. El pez cebra ofrece muchas ventajas que se pueden utilizar para evaluar rápidamente su capacidad de servir como sustituto para comprender las enfermedades renales humanas, como se analiza a continuación.

Detección basada en morfología

En la mayoría de los casos, los embriones de pez cebra mutantes muestran diferencias morfológicas, en comparación con el tipo salvaje, que pueden juzgarse fácilmente mediante observaciones bajo el microscopio. La transparencia de los embriones de pez cebra y su capacidad para sobrevivir hasta 5 días incluso con defectos de desarrollo graves es una gran ventaja en las pantallas basadas en morfología. Los cambios morfológicos comunes observados en embriones de pez cebra con pronefros defectuosos incluyen edema pericárdico, quistes pronéfricos, eje corporal curvo e hidrocefalia (Poureetezadi y Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). El edema es uno de los signos comunes de un riñón defectuoso que también se observa en otras deficiencias de órganos como el desarrollo del corazón (Hanke et al., 2013). Los mutantes con defectos renales pueden desarrollar quistes debido a otra sobreproliferación de células epiteliales, como se puede observar fácilmente al microscopio (Zhao y Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). A menudo se observa un eje del cuerpo curvo en mutantes que tienen defectos en los cilios pronéfricos. El pez cebra mutante como Locke (lok), shen yantf214a (shy), garbustm304 (grb) y zatortg238a (zar) son algunos otros ejemplos que muestran un eje del cuerpo curvo (Zhao y Malicki, 2007). Los mutantes de pez cebra con defectos renales muestran múltiples defectos morfológicos en el mismo embrión. La eliminación de dos genes de policistina pkd1a y pkd1b condujo al eje corporal curvado oralmente, hidrocefalia, cartílago y defectos craneofaciales con baja frecuencia de quistes pronéfricos (Mangos et al., 2010). Los mutantes de las proteínas de transporte intraflagelar ift57, ift88 e ift172, en los que los cilios eran defectuosos, tenían un eje del cuerpo curvado ventralmente (Lunt et al., 2009). Por lo tanto, los mutantes de pez cebra con riñones defectuosos exhiben muchas características morfológicas que pueden identificarse fácilmente.

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