MicroARN en el desarrollo y la enfermedad renal Ⅲ

MiARN en el tumor de Wilms

Tumor de Wilms,onefroblastoma, es la infancia más comúncáncer de riñón, con una incidencia de 1 de cada 10,000 niños en América del Norte (111). Es principalmente una enfermedad esporádica, aunque las formas familiares ocurren en aproximadamente el 1%-2% de los casos (112, 113). Los tumores de Wilms surgen de una nefrogénesis aberrante, donde los precursores renales embrionarios pluripotentes no logran diferenciarse y persistir.anormalmente en la vida posnatal(111, 114, 115). Estos tumores histológicamente se parecenriñones en desarrollocon unmorfología alterada(116), y las mutaciones en genes implicados en la nefrogénesis fetal, incluidos WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) y TP53 (123, 124), se asocian con aproximadamente el 40% de Tumores de Wilms (125). Estudios recientes que utilizaron la secuenciación del genoma completo y del exoma completo de tumores de Wilms identificaron nuevas mutaciones en genes de riesgo de cáncer (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), genes que codifican proteínas que median las modificaciones de las histonas durante la nefrogénesis (BCOR, MAP3K4) (126 ) y genes de procesamiento de miARN (121, 122, 128, 129).

¿CUÁNTO TIEMPO TARDA EN QUE CISTANCHE FUNCIONE PARA LOS PACIENTES CON ENFERMEDADES RENALES?

Entre los genes de procesamiento de miARN, se han informado mutaciones en DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 y XPO5 (codifica la exportina 5) en tumores de Wilms tratados con quimioterapia neoadyuvante y sin tratamiento previo (Figura 3) (121, 122, 128, 129 ). Alrededor del 33% de los tumores de Wilms examinados presentan mutaciones perjudiciales en genes de la vía de procesamiento de miARN (128). Una mutación recurrente (E1147K) en un residuo de unión a metal (Mg2+) del dominio RNasa IIIb de DROSHA, que parece ser exclusiva del tumor de Wilms, suprime la actividad catalítica de este dominio, lo que resulta en una mutación incompleta. escisión de pri-miRNA y reducción de la maduración de miRNA (128). Las mutaciones somáticas del punto de acceso que afectan el dominio RNasa IIIb de DICER1 alteran el procesamiento de los miARN 5p (aquellos derivados del brazo 5' de la horquilla del pre-miARN) (129) y a menudo se encuentran como mutaciones de "segundo impacto" que actúan en conjunto con DICER1. mutaciones de la línea germinal para inducir la tumorigénesis de Wilms en el síndrome DICER1 (un trastorno que aumenta la susceptibilidad a una variedad de tumores) (130-132). Aún no está claro por qué la función deteriorada de DICER1 en los tumores de Wilms da como resultado una nefrogénesis persistente y aberrante, a diferencia de la pérdida de Dicer1 en los progenitores de nefronas de ratón, que provoca un aumento de la apoptosis y el cese prematuro de la nefrogénesis (72–75). Algunas posibilidades potenciales incluyen que la actividad de la dosis del gen podría ser crucial para determinar la supervivencia celular o que las mutaciones en el dominio de la RNasa IIIb podrían afectar la especificidad de la unión del miARN por DICER1.

Las mutaciones en los genes de procesamiento de miARN están asociadas con la regulación negativa de miARN importantes, incluidos los miembros de las familias miR-200 (121) y let-7 (Figura 3) (121, 129). Dejemos que los -7 miARN y la proteína de unión a ARN Lin28 funcionen en conjunto para controlar el momento del cese de la nefrogénesis murina, posiblemente mediante la regulación del gen promotor del crecimiento Igf2 (133). La sobreexpresión de Lin28 durante el desarrollo renal provoca la expansión de los progenitores nefrogénicos, al inhibir su onda final de diferenciación, que culmina en una transformación neoplásica que recuerda mucho al tumor de Wilms humano (134). Se observa un aumento del número de copias de ADN de LIN28B y una pérdida de copias de ADN de let-7a en el 25% y el 46% de las muestras de tumor de Wilms humano, respectivamente (126). De acuerdo con estas observaciones, las mutaciones de la línea germinal en el gen humano DISL3L2, que codifica una exoribonucleasa responsable de degradar las formas preprocesadas de let-7, causan el síndrome de Perlman y la predisposición al tumor de Wilms (135, 136). El síndrome de Perlman es un síndrome de sobrecrecimiento congénito caracterizado por macrosomía, polihidramnios, dismorfología facial, displasia renal y nefroblastomatosis (una lesión precursora del tumor de Wilms) (137). Entre los lactantes con síndrome de Perlman que sobreviven más allá del período neonatal, el 64% desarrolla tumor de Wilms (138). Curiosamente, se encontraron deleciones completas o parciales de DISL3L2 en aproximadamente el 30% de los tumores de Wilms esporádicos examinados (136).

Un estudio reciente reforzó la importancia de la red reguladora de miARN en la etiología del tumor de Wilms. Los autores descubrieron que el gen 1 del adenoma pleiomórfico (PLAG1) es uno de los genes con regulación positiva más constante en los tumores de Wilms con mutaciones en los genes de procesamiento de miARN (125). La expresión ectópica de PLAG1 en el riñón de ratón en desarrollo provoca neoplasia, que se acompaña de la transactivación de su gen diana, el oncogén IGF2 del tumor de Wilms. miR-16 y miR-34, que están regulados negativamente en los tumores de Wilms, se identificaron como posibles reguladores de la expresión de PLAG1 (125). La Tabla 2 resume otros estudios que han informado sobre la expresión aberrante de miARN específicos asociados con la etiología del tumor de Wilms. Curiosamente, estos miARN pueden funcionar como oncogenes (llamados oncomiR) o supresores de tumores en el contexto del desarrollo del tumor de Wilms, dependiendo de la naturaleza de sus objetivos.

MiARN como posibles biomarcadores y agentes terapéuticos.

Además de su ubicación intracelular, los miARN también están presentes en cantidades significativas en los fluidos biológicos, como la sangre, el plasma, la orina, la leche materna y la saliva (139). Estos miARN circulantes se encuentran empaquetados envejecidos en micropartículas (exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos) (140, 141), conjugados con proteínas AGO (142) o nucleofosmina 1 (143), o cargados en HDL (144), lo que los hace notablemente estable incluso en condiciones desfavorables, como ebullición, variaciones extremas de pH, almacenamiento prolongado y múltiples ciclos de congelación y descongelación (145, 146). Por lo tanto, las firmas de miARN en fluidos biológicos pueden reflejar asociaciones con condiciones fisiológicas o patológicas (147). Juntas, estas características hacen que los miARN circulantes sean atractivos para su uso como biomarcadores no invasivos para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades.

Los miARN circulantes se pueden extraer directamente de fluidos biológicos no fraccionados o preparaciones de vesículas lares extracelulares utilizando kits de extracción disponibles comercialmente (148) o TRIzol (149). Tras el aislamiento, los miARN se pueden almacenar a –70 grados y permanecer estables hasta por 1 año (148). Hay varias plataformas disponibles para la elaboración de perfiles de miARN, incluida la hibridación de microarrays, qPCR y secuenciación de próxima generación (150). Los microarrays y qPCR son las metodologías más utilizadas para investigar la expresión de miARN conocidos (151). Ambos métodos tienen las ventajas de ser fáciles de usar, relativamente rápidos desde el etiquetado del ARN hasta la generación de datos y relativamente rentables (152). Sin embargo, dependen de la disponibilidad y la anotación precisa de secuencias de miARN en bases de datos para el diseño de sondas y cebadores (150). Aunque es más costosa, la secuenciación de próxima generación permite la detección simultánea de especies de miARN nuevas y conocidas y ofrece una alta sensibilidad (153). Además, la resolución de un solo nucleótido de la secuenciación de próxima generación permite la identificación de isomiR, que son isoformas de miARN maduros que difieren de las canónicas en longitud, secuencia o ambas (154, 155), que cambian la especificidad de direccionamiento del miARN (154, 155). 156).

Diversos estudios han investigado el potencial de los miARN circulantes como biomarcadores de enfermedades renales pediátricas (157-160). Por ejemplo, un estudio identificó 14 miARN que estaban significativamente regulados positivamente en el suero de pacientes con tumor de Wilms. Curiosamente, una firma basada en la expresión de miR-100-5p y miR-130-3p podría diferenciar a estos pacientes de los controles sanos con precisión, sensibilidad y especificidad (159). Aunque los hallazgos de este estudio y muchos otros han proporcionado una motivación convincente para explorar el potencial de los miARN circulantes como biomarcadores, es necesario superar varios obstáculos en el campo antes de una aplicación clínica generalizada. En primer lugar, existe una relativa falta de consenso entre los estudios, probablemente debido a la ausencia de una metodología estandarizada para la purificación (161) y el análisis de muestras (p. ej., diferencias en las plataformas de perfiles de miARN, referencias 162, 163; o diferencias en la biblioteca de smRNA-Seq). métodos de preparación, ref. 164). En segundo lugar, es la falta de estudios con muestras grandes e investigaciones detalladas sobre temas específicos.enfermedades.Otro aspecto importante es que la influencia de variables de confusión como la edad, el sexo y factores externos (p. ej., tabaco, alcohol, etc.) en los perfiles de miARN no se ha explorado completamente (para una revisión en profundidad, consulte la ref. 165).

Desde el punto de vista terapéutico, varios medicamentos basados ​​en miARN se encuentran actualmente en ensayos clínicos, pero aún no han obtenido la aprobación de la FDA (166, 167). Los principales enfoques para la terapia con miARN implican la restauración de los niveles de miARN utilizando imitadores de miARN o la inhibición de miARN específicos utilizando antagomiR (168). Uno de los desafíos asociados con el desarrollo de terapias basadas en miARN es la identificación de candidatos a miARN para cada enfermedad. Debido a que múltiples miARN están desregulados en cada enfermedad, se debe realizar un análisis cuidadoso de las muestras de pacientes en combinación con ensayos in vitro e in vivo que aborden los mecanismos fisiopatológicos afectados por los miARN en cuestión para limitar los miARN candidatos para la intervención terapéutica (168, 169). Otro desafío implica el desarrollo de estrategias para mejorar la estabilidad in vivo y la administración de fármacos en sitios específicos con una toxicidad mínima y efectos fuera del objetivo. Las moléculas de ARN son químicamente inestables debido a la presencia del grupo 2′-hidroxilo en el anillo de pentosa. Para proporcionar mayor estabilidad y protección contra las nucleasas presentes en el suero o en el compartimento endocítico de las células, las empresas de biotecnología han generado moléculas de ARN con modificaciones químicas (grupo 2′-O-metilo, fosforotioato o ácidos nucleicos bloqueados) en su columna vertebral (166). En cuanto a la administración in vivo, las tecnologías incluyen tecnologías basadas en lípidos (p. ej., nanopartículas lipídicas y liposomas neutros) y dendrímeros conjugados con un resto objetivo, entre muchas otras estrategias. Los principales desafíos asociados con los sistemas de administración de miARN son la inmunotoxicidad y la afinidad específica del objetivo hacia el sitio de la enfermedad (170). Las estrategias de administración mediante diversos métodos de administración (inyecciones intraperitoneales, intravenosas y subcutáneas) o mediante el uso de vectores que contienen promotores inducibles y específicos del riñón se han utilizado con éxito para dirigirse selectivamente al riñón y evitar posibles efectos adversos en otros tejidos y órganos (171, 172). ).

Tabla 2. Lista de miARN alterados en el tumor de Wilms

Lista de miARN, muestras/espécimenes analizados, niveles de miARN observados en estas muestras/especímenes en comparación con controles apropiados, gen objetivo, consecuencias de los cambios de miARN y referencias. CAMKK2, proteína quinasa quinasa 2 dependiente de calcio/calmodulina; CDC7, ciclo de división celular 7; CDH1, cadherina 1; CREB1, proteína 1 de unión al elemento de respuesta a AMPc; EYA1, ojos ausentes homólogo 1; E2F3, factor de transcripción 3 E2F; FRS2, sustrato 2 del receptor de FGF; Glut1, transportador de glucosa 1; IGF1R, receptor de IGF1; Jag1, dentado1; MET: transición mesenquimal-epitelial; MKNK1, serina/treonina quinasa 1 que interactúa con MAPK; PTEN, homólogo de fosfatasa y tensina; PUMA, p53-modulador regulado positivamente de la apoptosis; p73, proteína tumoral p73; SIX1, homólogo 1 de la homeobox de sineoculis; TGFBR1, receptor 1 de TGF; WT, tumor de Wilms.

Resumen

Ha habido una explosión de información sobre la biogénesis de miARN, la regulación de la expresión de miARN y la función de miARN desde el descubrimiento inicial de los miARN en 1993 (6, 7). Esto ha ido acompañado de una comprensión cada vez mayor de cómo funcionan los miARN tanto en la fisiología normal como en la fisiopatología de muchas enfermedades. Ha quedado claro que la desregulación de la expresión de miARN altera el desarrollo temprano del riñón y está implicada en la patogénesis de enfermedades renales del desarrollo, como CAKUT y el tumor de Wilms. Con los recientes avances en el uso de miARN como biomarcadores y como nuevos objetivos farmacológicos, es fundamental conocer cómo los miARN regulan el desarrollo y la enfermedad renal para comprender cómo podrían utilizarse en nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos para estas enfermedades. Para realizar plenamente estos esfuerzos, son fundamentales estudios futuros que identifiquen la función de miARN específicos en el desarrollo renal, además de tecnologías para optimizar la orientación de terapias con oligonucleótidos pequeños al riñón.

Expresiones de gratitud

El laboratorio de JH cuenta con el apoyo de subvenciones del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los NIH (R01DK125015 y R01DK102843). DMC recibió el apoyo del Premio al Desarrollo Profesional de la Red de Estudios sobre el Síndrome Nefrótico y la beca postdoctoral del Consejo Asesor de Investigación del Hospital Infantil de Pittsburgh. MT contó con el apoyo del Programa de pasantías de investigación de verano de la Universidad de Pittsburgh (R25DK119180). Las figuras fueron creadas con BioRender.com. Dirija la correspondencia a: Jacqueline Ho, División de Nefrología, Departamento de Pediatría, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, EE. UU. Teléfono: 412.692.9440; Correo electrónico: jacqueline.ho2@chp.edu.

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