Los microARN dan forma a la inmunidad social: un objetivo potencial para el control biológico de la termita Reticulitermes Chinensis

Abstracto

Los insectos eusociales pueden emplear diversas defensas fisiológicas y de comportamiento contra enfermedades para evitar, resistir y tolerar infecciones por patógenos en sus colonias estrechamente relacionadas y apiñadas, lo que se denomina inmunidad social. Estudios recientes han demostrado que varias moléculas contribuyen a la inmunidad social de los insectos, incluidos olores químicos, venenos de insectos, proteínas relacionadas con el sistema inmunológico, etc. Sin embargo, se desconoce si los microARN (miARN), cuyos precursores son procesados ​​por Dicer-1, impulsan la inmunidad social y cómo lo hacen. Aún se desconoce la inmunidad en las colonias de insectos. Aquí, utilizamos un sistema 'huésped-patógeno' (huésped: Reticulitermes chinensis; patógeno: Metarhizium anisopliae) para explorar el impacto de los miARN en la inmunidad social en colonias de termitas. Descubrimos que el silenciamiento de Dicer-1 mediado por ARNi condujo a una disminución de la concentración de miARN, inhibió significativamente el metabolismo energético y de carbohidratos y afectó otros procesos vitales, como la respuesta inmune y las reacciones de oxidación-reducción, en todo el cuerpo de la termita. . En defensa del comportamiento, silenciar a Dicer-1 disminuyó significativamente los comportamientos sociales defensivos como la locomoción, el aseo, el canibalismo y el entierro en grupos de termitas cuando se encuentran contaminación por hongos. En defensa fisiológica, el silenciamiento de Dicer-1 y la estimulación de miR- 71-5 dieron como resultado una disminución significativa de las actividades antifúngicas de las termitas. Además, tanto los grupos de termitas silenciadas con Dicer-1- como las tratadas con estimulantes miR-71-5 exhibieron un alto nivel de mortalidad durante la contaminación por hongos. Nuestros hallazgos demostraron el importante papel de los miARN en la configuración de la inmunidad social en las colonias de termitas, proporcionando los conocimientos necesarios para comprender los mecanismos potenciales subyacentes a las defensas fisiológicas y conductuales contra las enfermedades en los insectos y, por lo tanto, sentando las bases para el control de plagas basado en miARN.

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Palabras clave Insecto eusocial · Hongos entomopatógenos · Defensas contra enfermedades · Dicer-1 · miR-71-5

Mensaje clave

• Expresiones genéticas mediadas por miARN relacionadas con sistemas inmunológicos sociales.

• Los miARN afectaron las defensas contra las enfermedades del comportamiento en los grupos de termitas.

• Los miARN influyeron en la defensa fisiológica contra las enfermedades en individuos de termitas.

• Los termiticidas basados ​​en miARN podrían considerarse accesos novedosos al control biológico de plagas.

Introducción

Las termitas son plagas económicamente importantes, cuestan 30 mil millones de dólares en todo el mundo e imponen daños globales a cultivos, árboles, estructuras de madera y materiales de celulosa. Los pesticidas químicos proporcionan una vía de control eficaz para las plagas de termitas, pero también crean problemas graves que amenazan la salud humana y el medio ambiente. El control biológico es una alternativa valiosa que puede abordar estos problemas. Varios entomopatógenos, como Metarhizium y Beauveria, se han aplicado con éxito para el control biológico de plagas, que es razonable y eficaz (Verma et al. 2009; Kumar y Upadhyay 2021). Sin embargo, el control biológico de las termitas es insatisfactorio, principalmente debido a las defensas únicas contra las enfermedades en las colonias de termitas. Las termitas, al ser insectos eusociales, han desarrollado defensas fisiológicas individuales y de comportamiento colectivo para contrarrestar el alto riesgo de propagación de patógenos infecciosos entre compañeros de nido estrechamente empacados y relacionados (denominado 'inmunidad social') (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. .2019a). Está bien documentado que las termitas despliegan un amplio repertorio de defensas conductuales: la evasión es la primera línea de defensa y ayuda a evitar que las termitas entren en áreas contaminadas (Yanagawa et al. 2015); el comportamiento de alarma se exhibe con un rápido movimiento oscilatorio longitudinal para advertir a los compañeros de nido sobre la presencia de patógenos (Rosengaus et al. 1999); acicalarse hacia compañeros de nido contaminados con patógenos puede eliminar eficazmente los patógenos de las cutículas de los compañeros de nido (Liu et al. 2019b); los comportamientos caníbales y de entierro limitan la transmisión de patógenos de los cadáveres a compañeros de nido susceptibles (Sun et al. 2016). Las respuestas fisiológicas, como las respuestas inmunitarias y las reacciones de oxidación-reducción, también sirven como defensa contra las enfermedades de las termitas. Las respuestas inmunes incluyen péptidos antimicrobianos (AMP) mediados por inmunidad humoral y fagocitosis y encapsulación mediadas por inmunidad celular, que son capaces de inhibir la replicación y diseminación de patógenos en la cavidad corporal del insecto (Hussain et al. 2013; Liu et al. 2015; López-Uribe et al. 2016; Hong et al. 2018). Las reacciones de oxidación-reducción mitigan el daño causado por las toxinas y las especies reactivas de oxígeno (ROS) durante las infecciones por patógenos, lo que contribuye a la tolerancia de los insectos (Liu et al. 2015; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Además, estudios previos sobre las defensas contra las termitas han demostrado que algunos simbiontes intestinales eran un componente importante de la defensa fisiológica del huésped (Rosengaus et al. 2014). Algunos AMP podrían emplearse como desinfectantes externos en la superficie de la cutícula y en los materiales de los nidos cuando se combinan con comportamientos como el aseo y la anidación (Bulmer et al. 2009; Hamilton y Bulmer 2012). Por lo tanto, debilitar las defensas fisiológicas y de comportamiento de las termitas puede ser el paso clave para mejorar el efecto de biocontrol de las termitas.

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La base molecular de la inmunidad social se ha informado en un número creciente de estudios. Se han identificado varias moléculas, incluidos olores químicos, secreciones externas, antibióticos, proteínas inmunes y quimiorreceptores que sirven a las defensas fisiológicas y de comportamiento de los insectos, mediante múltiples técnicas ómicas y cromatografía de gases/líquidos-espectrometría de masas (Seipke et al. 2011; Hussain et al. 2013; Terrapon et al. 2014; Liu et al. 2015; Sun et al. 2016; He et al. 2018). En los grupos de termitas, el olor a humedad de los patógenos induce un mejor comportamiento de aseo (Yanagawa et al. 2011). Las señales de muerte de los cadáveres de termitas inducen canibalismo o comportamientos de entierro (Sun et al. 2016). Las secreciones externas de las glándulas frontales y salivales y la actividad antimicrobiana mediada por microorganismos beneficiosos ayudan a las termitas a protegerse a sí mismas, a sus compañeros de nido e incluso a las colonias (Bulmer et al. 2009; Rosengaus et al. 2000, 2014; Chouvenc et al. 2013). Para los mecanismos genéticos y bioquímicos que impulsan la inmunidad social de los insectos, se podrían utilizar tecnologías de edición de genes y ARNi. En las termitas, se ha demostrado que el silenciamiento mediado por ARNi de los genes de termicina, proteína de unión gramnegativa 2 (GNBP2), proteína de unión a selenio y transglutaminasa (TG) disminuye significativamente la actividad antifúngica de las termitas y, por lo tanto, aumenta la mortalidad por infección (Hamilton y Bulmer 2012; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). La isocitrato deshidrogenasa (IDH) podría influir en el metabolismo de las termitas y su desregulación induce un aumento de las lesiones apoptóticas, lo que provoca altos niveles de infecciones y mortalidad (Liu et al. 2020). Además, GNBP2 y TG también sirven para la defensa conductual de las termitas, influyendo en los comportamientos caníbales y de acicalamiento, respectivamente (Zhao et al. 2020; Esparza-Mora et al. 2020). Sin embargo, las bases moleculares de la inmunidad social aún no se han entendido claramente, especialmente el mecanismo molecular que impulsa los complicados comportamientos sociales en respuesta a patógenos infecciosos. Además, el mecanismo genético y bioquímico de la inmunidad social se centra en el ARN codificante que impulsa la inmunidad social de los insectos, pero aún no está claro si los ARN no codificantes, como los miARN, participan en la regulación de la inmunidad social de los insectos.

Dicer-1, una endonucleasa ARNasa III, es esencial para el paso final de la biosíntesis de miARN. Los miARN son ARN no codificantes endógenos, de 18 a 25 nt, que regulan negativamente la expresión génica en el nivel postranscripcional mediante el emparejamiento de bases entre la región semilla en los miARN y la región coincidente en los ARNm diana (Gomez-Orte y Belles 2009; Wang et al. 2013; Yang et al. 2014; Lucas et al. 2015). Como la producción de miARN depende de Dicer-1, las funciones de los miARN en la modulación de los procesos biológicos de los insectos pueden estudiarse mediante las pérdidas funcionales de Dicer-1. Mediante el uso de mutantes Dicer-1 de moscas de la fruta, se ha demostrado que los miARN funcionan en la embriogénesis y la morfogénesis de las neuronas olfativas (Lee et al. 2004; Berdnik et al. 2008). Mediante el silenciamiento de Dicer-1 mediado por ARNi, los investigadores han verificado que los miARN desempeñan un papel clave en la regulación de los procesos de desarrollo en la metamorfosis de insectos, como los de las cucarachas y las langostas (Gómez-Orte et al. 2009; Wang et al. 2013). Además, los miARN también participan en la modulación del comportamiento de los insectos. miR-8 y miR-429 regulan el comportamiento trepador inducido por virus en los gusanos del algodonero controlando directamente la expresión de BrZ2 (Zhang et al. 2018). miR-133 regula la síntesis de dopamina y, por lo tanto, inhibe la agregación conductual en la langosta (Yang et al. 2014). Con base en dicha evidencia sobre la función de los miARN en la fisiología y el comportamiento de los insectos, nuestro objetivo fue determinar el efecto de los miARN en la fisiología y el comportamiento de las termitas involucrados en la inmunidad social mediante el uso de un sistema 'huésped-patógeno' (hospedador: Reticulitermes chinensis; patógeno: Metarhizium anisoplias). Nuestro estudio incluyó principalmente tres aspectos de la investigación sobre la inmunidad social: el efecto de los miARN en (1) las moléculas in vivo que impulsan la inmunidad social; (2) la respuesta defensiva conductual, como la locomoción en áreas contaminadas con hongos, acicalamiento hacia compañeros de nido contaminados con hongos y canibalismo/entierro hacia cadáveres contaminados con hongos; y (3) la respuesta de defensa fisiológica, como la actividad antifúngica. Además, probamos el efecto de la desregulación de los miARN sobre la mortalidad de termitas contaminadas con hongos para evaluar el efecto de los miARN sobre el control biológico de las termitas. Nuestro estudio reveló el mecanismo potencial subyacente a las defensas contra enfermedades fisiológicas y conductuales y nuevos objetivos para el control de plagas.

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material y métodos

termitas

Todas las termitas experimentales en nuestro estudio eran obreras de la termita R. chinensis. Fueron recolectados en la colina Shizi en la ciudad de Wuhan, provincia de Hubei, China. Las termitas se criaron en recipientes de plástico (40 × 20 × 20 cm) que contenían pequeños bloques de pino en el laboratorio a una temperatura de 25 ± 1 grado, 80% de humedad relativa y 24 h de oscuridad.

Entomopatógenos, termitas contaminadas y cadáveres.

El hongo entomopatógeno M. anisopliae (cepa IBCCM321.93) se cultivó en agar papa dextrosa (PDA) durante 2 semanas a 25 ± 1 grado, 8 0 % de humedad relativa y 24 h de oscuridad. Los conidios fúngicos se suspendieron usando Tween 80 al 1% y se almacenaron a una temperatura de 4 grados durante un máximo de 3 a 4 semanas. Antes de cada experimento, se probó la germinación de la suspensión de conidios. Descubrimos que la suspensión de conidias utilizada para contaminar termitas tenía una tasa de germinación de más del 90%. Para preparar termitas contaminadas con hongos, los abdómenes de las termitas se contaminaron con una gota de 0,3 μl de suspensión de conidias (108 conidios/ml) utilizando una pipeta (0,1–2,5 μl, Transferpette). Luego, las termitas contaminadas con el hongo se refrigeraron inmediatamente a 4 grados durante una hora para inhibir su movimiento y precipitar conidios fúngicos en sus cutículas (Liu et al. 2015). Para preparar cadáveres contaminados con hongos, se recogieron las termitas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y luego se congelaron en nitrógeno líquido durante 20 segundos para matarlas. Los cadáveres se sumergieron en la suspensión de conidios (108 conidios/mL) y luego se colocaron en una placa de Petri estéril con papel de filtro húmedo durante 0 y 2 días de cultivo (Sun et al. 2016).

Síntesis de dsRNA y el simulante de miRNA.

El fragmento Dicer-1 (1697 pb; material complementario 1-Texto S1) se amplificó mediante cebadores específicos (adelante: 5′-CTG CGA CAG ATC ATT GCA CG-3′; inverso: 5′ -CAC TGG CTG TTT TGG CAC TC-3′), y sus productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción en gel de ADN AxyPrepTM (Axygen Scientific, EE. UU.), y se clonaron en el vector pMD 18-T (TaKaRa, Japón) y luego se transformó utilizando una célula químicamente competente DH5 (Tsingke Biotechnology, China). Se envió una única colonia del medio caldo de lisogenia (LB) con ampicilina a Tsingke Biotechnology Co. Ltd. para su secuenciación. El alineamiento de secuencias mostró que nuestro fragmento era Dicer-1. La secuencia del promotor T7 (5′-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3′) se añadió al extremo 5′ de los cebadores de amplificación de Dicer-1 (519 pb; Adelante: 5′ -GTG ATG CTG GAG TTG GGT TT-3′; Inversa: 5′-AGA ATG AGT CGC CCA ATG TC-3′) y GFP (467 pb; Adelante: 5′-CTT GAA GTT GAC CTT GAT GCC-3′; Reverso: plantillas de ARNbc 5′-TGG TCC CAA TTC TCG TGG AAC- 3′) (Material complementario 1-Texto S1). Los productos de PCR de las plantillas de ARNbc se extrajeron con hidroxibenceno/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) (Solarbio, China). El ARNbc se generó utilizando un kit de transcripción de ARNi T7 (Vazyme Biotech, China) y luego se purificó con hidroxibenceno/cloroformo/alcohol isoamílico (50:49:1) (Solarbio). Finalmente, el ARNbc se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa y un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EE. UU.) y se almacenó a 80 grados.

El simulante de miR-71-5 era un pequeño ARN de doble hebra diseñado según la secuencia de miR-71-5 (21 nt, material complementario 1-Texto S1). La plantilla del simulante miR-71-5 consistía en dos ADN bicatenarios que contenían el promotor T7: uno fue generado por el oligonucleótido A1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A -3′) y oligonucleótido A2 (5′-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) usando PCR de aterrizaje; el otro fue generado por el oligonucleótido B1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAA A-3′) y el oligonucleótido B2 (5′-TTT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) utilizando PCR de aterrizaje. Se diseñó un simulante de control de acuerdo con la secuencia de GFP (19 nt, material complementario 1-Texto S1). La plantilla del simulante de control también fue adquirida por dos ADN bicatenarios que contienen el promotor T7: uno fue generado por el oligonucleótido C1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT AA{{33} }′) y oligonucleótido C2 (5′-TTA ACT TCA GGG TCA GCT TGC CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) usando PCR de aterrizaje; el otro fue generado por el oligonucleótido D1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC AA-3′) y el oligonucleótido D2 (5′-TTG CAA GCT GAC CCT GAA GTT CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) utilizando PCR de aterrizaje. Los simulantes de miR-71-5 y de control se generaron utilizando un kit de transcripción de ARNi T7 y luego se extrajeron con hidroxibenceno/cloroformo/alcohol isoamílico (50:49:1). El extracto se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa y un NanoDrop 2000 y se almacenó a -80 grados.

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alimentación de ARNbc

Las termitas pasaron hambre durante 12 horas antes de ser alimentadas (Zhou et al. 2008; Hamilton y Bulmer 2012). Un total de 18 termitas se colocaron en una placa de Petri celular (D =35 mm) con un trozo de papel de filtro (D =18 mm) que se humedeció con 60 μL de agua libre de RNasa que contenía 80 ug. dsDicer-1, 80 ug de dsGFP, 60 ug de simulante de miARN o 60 ug de simulante de control. Para los bioensayos de alimentación de ARNds de Dicer-1, se permitió que las termitas ingieran el papel humedecido durante 24 horas antes de los experimentos. Las termitas tratadas con GFP se consideraron controles. Para los bioensayos de alimentación con simulación de miARN, se permitió que las termitas ingieran el papel humedecido durante 48 horas antes de los experimentos. Las termitas de control tratadas con simulante se consideraron controles.

RT‑qPCR

Se utilizaron cinco o seis réplicas de tres colonias para la expresión génica mediante RT-qPCR. Se agruparon tres termitas por réplica por tratamiento para la extracción de ARN total utilizando el kit Direct-zol™ RNA Miniprep (Zymo Research, EE. UU.). La pureza y concentración del ARN extraído se determinaron utilizando un NanoDrop 2000. El ARN se convirtió en ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScript™ RT con gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Japón). La RT-qPCR se realizó con un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 3 (Thermo Scientific) utilizando ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech). Los cebadores específicos se enumeran en el Material complementario 2-Tabla S1.

concentración de miARN

Se utilizaron seis réplicas de tres colonias para determinar la concentración de miARN utilizando un kit de miARN de tejido/célula MiPure (Vazyme Biotech, China). Se agruparon tres termitas por réplica por tratamiento para los miARN. La pureza y concentración de los miARN extraídos se determinaron utilizando un NanoDrop 2000.

Secuenciación de novo y análisis del transcriptoma para

Fifteen termites from three colonies per treatment were pooled for total RNA extraction using TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA). The concentration, quality, and integrity of the total RNA were determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific). Sequencing libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, USA) and sequenced on a HiSeq platform (Illumina) by Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. (China). Sequencing data were filtered by Cutadapt (v1.15) software. For the transcriptome sequencing project without a reference genome, Trinity (v2.5.1) software was used to montage clean reads for the transcripts for later analysis. NR (NCBI non-redundant protein sequences), GO (Gene Ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome), Egg NOG (Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups), and Swiss-Prot databases were used for gene functional annotation. Furthermore, DESeq (1.30.0) was used to analyze the differentially expressed genes under the condition of |log2FoldChange(FC)|>1 yp<0.05. The genes were then mapped to GO terms, and the terms with significant enrichment were calculated by hypergeometric distribution under the condition of p<0.05 to reveal the possible functions of the candidate genes. Additionally, the genes were mapped to KEGG pathways to determine their possible functions. 

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Locomoción

Se analizaron nueve réplicas de tres colonias para comparar la distancia de movimiento de las termitas silenciadas con Dicer-1- frente a las tratadas con GFP. Después de un día de alimentación oral con dsDicer-1 o dsGFP, se colocó una termita por réplica por tratamiento en una nueva placa de Petri de células (D =90 mm) con un trozo de papel de filtro humedecido con la suspensión de conidios. (108 conidias/mL). Luego, utilizamos un marcador negro para trazar el movimiento de la termita sobre una tapa transparente durante 10 segundos. La distancia de movimiento se midió utilizando papel cuadriculado (1 × 1 mm).

Aseo

Se analizaron nueve réplicas de tres colonias para comparar el número de comportamientos de aseo entre las termitas silenciadas con Dicer- 1- y las tratadas con GFP. Después de un día de alimentación oral con dsDicer-1 o dsGFP, se colocaron tres termitas por réplica por tratamiento en una nueva placa de Petri de células (D =35 mm) con un trozo de papel de filtro humedecido (D{{ 4}} mm) y luego contaminado con conidios fúngicos (108 conidios/mL). Los comportamientos se grabaron en vídeo durante 15 minutos utilizando una cámara digital HD (SONY, Japón). Los videos se escanearon cada 10 segundos para observar si se producían comportamientos de acicalamiento (bocas de termitas hacia cuerpos de compañeros de nido) entre termitas contaminadas con hongos.

Canibalismo

Se analizaron nueve réplicas de tres colonias para determinar el efecto de Dicer{{0}} frente a GFP sobre el comportamiento caníbal hacia cadáveres contaminados con hongos. Se colocaron seis termitas por réplica por tratamiento en una placa de Petri celular (D=35 mm) con un trozo de papel de filtro húmedo (D=18 mm) que contenía dsDicer-1 o dsGFP. Se les permitió un día de alimentación oral con ARNbc y luego, un cadáver contaminado con hongos incubado durante 0 días se colocó en la placa de Petri celular donde se criaron las seis termitas tratadas. Después de un día de crianza juntos, el cadáver contaminado con hongos fue comido completamente (puntuación alta en la prueba=2), parcialmente comido (puntuación baja en la prueba=1) o no comido (sin puntuación en la prueba{{10 }}) (Material complementario 1-Fig. S1) por las seis termitas.

Entierro

Se analizaron nueve réplicas de dos colonias para determinar el efecto de Dicer-1 frente a GFP en el comportamiento de entierro de cadáveres contaminados con hongos. Se colocaron seis termitas por réplica por tratamiento en una placa de Petri celular (D=35 mm) con un trozo de papel de filtro húmedo (D=18 mm) que contenía dsDicer-1 o dsGFP. Se les permitió un día de alimentación oral de ARNbc. Luego, se incubó un cadáver contaminado con hongos durante 2 días y se añadió tierra a la placa de Petri en la que se criaron las seis termitas tratadas. Después de un día de crianza juntos, el cadáver contaminado con hongos fue completamente enterrado (puntuación alta en la prueba=2), parcialmente enterrado (puntuación baja en la prueba=1) o no enterrado (sin puntuación en la prueba{{10 }}) (Material complementario 1-Fig. S2) por las seis termitas.

Actividad antifúngica

Se analizaron seis réplicas de tres colonias para determinar el impacto de Dicer{{0}} y miR-71-5 en la capacidad de las termitas para inhibir el crecimiento de hongos. Se agruparon y trituraron cinco termitas por réplica por tratamiento con nitrógeno líquido y luego se disolvieron en 100 μL de solución salina al 0,9 %. El homogeneizado se centrifugó a 6000 xg durante cinco minutos a 4 grados para producir 80 µl de sobrenadante. Luego, el sobrenadante se centrifugó nuevamente para producir 50 µL de sobrenadante. Para la actividad antifúngica, se usó una microplaca de 96-pocillos para medir la absorbancia de las muestras, controles de crecimiento y blancos estándar para calcular la reducción del crecimiento fúngico: (1) 50 μL de dextrosa de papa (PD), 2 Para la muestra se mezclaron μL de conidias fúngicas (108 conidias/mL) y 5 μL del sobrenadante por pocillo; (2) Se mezclaron 50 μL de dextrosa de papa (PD), 2 μL de conidios fúngicos (108 conidios/mL) y 5 μL de solución salina al 0,9 % por pocillo para controlar el crecimiento de los hongos; (3) Se mezclaron 50 µL de dextrosa de papa (PD) y 7 µL de solución salina al 0,9 % por pocillo para el blanco estándar. Después de 24 h de cultivo en un agitador a temperatura constante (150 rpm a 25 ± 1 grado), se realizó la medición en un espectrofotómetro de microplacas (600 nm; Thermo Scientific).

Supervivencia

Para determinar el efecto de la alimentación oral de dsDicer-1 sobre la supervivencia de las termitas, se desplegaron termitas de tres colonias para determinar la supervivencia de Dicer-1-silenciado (42 termitas en total, 14 termitas por colonia) y GFP- termitas tratadas (42 termitas en total, 14 termitas por colonia) durante la contaminación por hongos. Para los controles, se desplegaron 56 termitas de dos colonias para determinar la supervivencia de las termitas silenciadas con Dicer-1- (28 termitas en total, 14 termitas por colonia) y las termitas tratadas con GFP (28 termitas en total, 14 termitas por colonia). Al realizar los experimentos, se criaron siete termitas en una placa de Petri celular (D =35 mm) con un trozo de papel de filtro (D =18 mm) humedecido con agua libre de RNasa que contenía dsDicer{{17} } o dsGFP, mientras que las termitas fueron contaminadas con hongos y luego criadas durante diez días para observar diariamente su supervivencia. Para determinar el efecto de la alimentación oral del simulante miR-71-5 sobre la supervivencia de las termitas, se desplegaron termitas de tres colonias para determinar la supervivencia de miR-71-5 (42 termitas en total, 14 termitas por colonia) y el control ( 42 termitas en total, 14 termitas por colonia) termitas tratadas con simulante durante la contaminación por hongos. Además, se desplegaron 56 termitas de dos colonias para determinar la supervivencia de las termitas tratadas con simulantes miR- 71-5 (28 termitas en total, 14 termitas por colonia) y control (28 termitas en total, 14 termitas por colonia). Al realizar los experimentos, se criaron siete termitas en una placa de Petri de células (D=35 mm) con un trozo de papel de filtro (D=18 mm) humedecido con agua libre de RNasa que contenía miR{{35} } simulante o simulante de control. Después de dos días de alimentación oral, las termitas fueron contaminadas con hongos y luego criadas durante diez días para observar diariamente su supervivencia. Las termitas muertas fueron eliminadas a tiempo.

análisis estadístico

Todos los análisis de datos se realizaron en IBM SPSS, versión 19. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para detectar si los conjuntos de datos estaban distribuidos normalmente. Dado que los datos de expresión genética, canibalismo y entierro estaban distribuidos de manera anormal, se utilizó la prueba de Wilcoxon. Alternativamente, los datos de concentración de miARN, locomoción, aseo y actividad antifúngica se distribuyeron normalmente y se utilizó una prueba t pareada. La supervivencia se analizó mediante el método de Kaplan-Meier para la esperanza de vida en las diferentes condiciones de tratamiento. El nivel de significancia fue p<0.05 in this study.

Resultados

Perfil de expresión de ARNm de termitas silenciadas con Dicer-1

Para determinar el efecto de Dicer{{0}} en el perfil de expresión génica de las termitas, se realizó la secuenciación del ARNm de Dicer-1-termitas silenciadas. Después de 1 día de alimentación oral de dsDicer-1, expresión de Dicer-1 (Fig. 1A; n=6, p <0,05; prueba de Wilcoxon) y, por tanto, concentración de miARN (Fig. 1B; gl). =5, pág.<0.05; paired t-test) were significantly decreased in termites. A total of 1262 mRNAs were significantly altered in the whole bodies of Dicer-1-silenced termites (upregulated: 562 mRNAs; downregulated: 700 mRNAs; Fig. 1C and Supplementary material 2-Table S2). The differentially expressed genes (DEGs) were mapped to the salivary secretion, glycolysis, citrate cycle, and 29 other KEGG pathways (Fig. 1D–F and Supplementary material 2-Table S3). In addition, the DEGs were clustered into the ATP generation from ADP, structural constituent of the cuticle, defense response, glutathione transferase activity, oxidation–reduction process, and 171 other GO terms (Fig. 2 and Supplementary material 2-Table S4).

Fig. 1 Perfil de expresión genética en cuerpos completos de termitas autorizadas por Dicer-1-. Una expresión Dicer-1. Los datos se muestran como la media ± SEM. *pag<0.05. B The concentration of miRNAs. The data are shown as the mean±SEM. *p<0.05. C The number of diferentially expressed genes (DEGs). D The DEGs mapped to salivary secretion. ATP1B, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta; ATP2B, Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1; PKC, Protein kinase C alpha type; CALM, Calmodulin-like protein; LYZ, Lysozyme C. E The DEGs mapped to glycolysis. GPI, Glucose-6-phosphate isomerase; PFKC, ATP-dependent 6-phosphor fructokinase; TIM, Triosephosphate isomerase; GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PGK, Phosphoglycerate kinase; MINPP1, Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1; GPMA, 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase; ENO, Enolase. F DEGs mapped to citrate cycle. PCK, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP]; PYC, pyruvate carboxylase; MDH1, malate dehydrogenase; SUCD, succinate–CoA ligase [ADP-forming]. Red letters indicate upregulation; blue letters indicate downregulation

Fig. 2 Mapas de calor de DEG agrupados en términos GO relacionados con la defensa. Una generación de ATP a partir de ADP. B Constituyente estructural de la cutícula. C Respuesta de defensa. D Actividad de glutatión transferasa. E Proceso de oxidación-reducción

Verificación RT-qPCR de DEG de mRNA-seq

La glucólisis, el ciclo del citrato y la generación de ATP a partir del ADP se relacionaron con el metabolismo energético y de carbohidratos, en el que ocho DEG (gliceraldehído{{0}}fosfato deshidrogenasa, 2,3-fosfoglicerato mutasa dependiente de bisfosfoglicerato, Se verificó que la enolasa, la triosafosfato isomerasa, la 6-fosfofructoquinasa dependiente de ATP, la fosfoenolpiru vato carboxiquinasa [GTP], la succinato-CoA ligasa [formadora de ADP] subunidad alfa-2 y la malato deshidrogenasa) estaban significativamente reguladas a la baja después de Dicer. -1 silenciamiento (Fig. 3A–H; n=6, p < 0,05; prueba de Wilcoxon), lo que sugiere trastornos de la glucólisis, el ciclo del citrato, la generación de ATP y, por tanto, el metabolismo de los carbohidratos y la energía en todo el cuerpo. de Dicer-1-termitas silenciadas. Los DEG (defensina y terminicina) en la respuesta de defensa codificaron AMP. La expresión de estos genes aumentó significativamente en las termitas silenciadas con Dicer-1- en comparación con la de las termitas tratadas con GFP (Fig. 3I, J; n=5 o 6, p<0.05; Wilcoxon test). In the oxidation–reduction process, cytochrome P450 9e2 and peroxiredoxin-4 were significantly altered after Dicer-1 silencing in termites (Fig. 3K, L; n = 6, p<0.05; Wilcoxon test). These results implied an important effect of Dicer-1 on the immune response and oxidation–reduction reaction in whole-body of the termites. The effect of Dicer‑1 on behavioural disease defences in termite groups 

Para determinar el efecto de Dicer-1 en la respuesta conductual a la contaminación por hongos, probamos cuatro defensas conductuales importantes: locomoción, aseo, canibalismo y entierro, en termitas silenciadas por Dicer-1-. Nuestros resultados mostraron que la locomoción (Fig. 4A, t=7.013, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S3 and Video S1), grooming (Fig. 4B, t=5.949, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S4 and Video S2), cannibalistic (Fig. 4C, n =9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S1 and Video S3) and burial (Fig. 4D; n=9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S2 and Video S4) behaviors were significantly reduced in Dicer-1-silenced termites compared to GFP-treated termites, suggesting an important role of Dicer-1 in driving behavioral disease defenses in termite colonies.

Fig. 3 Verificación por RT-qPCR de DEG de mRNA-seq. Genes A–H asociados con el metabolismo energético y de carbohidratos. Genes I – J asociados con la respuesta inmune. Genes K – L asociados con reacciones de oxidación-reducción. Los datos se muestran como la media ± SEM. *pag<0.05

El efecto de Dicer‑1 y miR‑71‑5 sobre las capacidades antifúngicas de las termitas

Para determinar el efecto de los miARN en la respuesta fisiológica a la contaminación por hongos, probamos las actividades antifúngicas totales de las termitas silenciadas por Dicer-1-. Nuestros resultados mostraron que la actividad antifúngica disminuyó significativamente (Fig. 5A; t=−3.046, df=5, p<0.05; paired t-test) in Dicer-1-silenced termites. Furthermore, miR-71-5 was selected for further testing to determine its role in physiological defense, which was chosen according to the comparative profiling of miRNAs and mRNAs in fungus-contaminated versus naive termites and miRNA-mRNA analysis (data unpublished). We found that the antifungal activity (Fig. 5B; t=−4.000, df=5, p<0.05; paired t-test) was significantly reduced in termites treated with miR-71-5 simulants compared to those treated with simulant controls. These results suggested that miRNAs played an important role in driving physiological disease defenses in termites.

Fig. 4 Efecto de la desregulación de miARN sobre las conductas sociales defensivas en grupos de termitas. A Locomoción, B acicalamiento, C caníbal y D Comportamientos de entierro de grupos de termitas silenciadas con Dicer-1- versus grupos de termitas tratadas con GFP. Los datos se muestran como la media ± SEM. *pag<0.05, **p<0.01

Fig. 5 Efecto de la desregulación de miARN sobre la defensa fisiológica en individuos de termitas. Actividad antifúngica de termitas Dicer-1-silenciadas frente a termitas tratadas con GFP. B Actividad antifúngica de miR-71-5 versus termitas de control tratadas con simulante. Los datos se muestran como la media ± SEM. *pag<0.05

Dicer‑1 y miR‑71‑5 influyeron en la supervivencia de termitas contaminadas con hongos

Dado que los simuladores dsDicer-1 y miR-71-5 condujeron a una reducción de la actividad antifúngica de las termitas, probamos su potencial para el control biológico de las termitas. Descubrimos que las termitas silenciadas con Dicer-1-contaminadas con hongos exhibieron una supervivencia significativamente menor en comparación con la de otras termitas tratadas (dsDicer-1+hongo versus dsGFP+hongo: χ2=81.839, p.<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsDicer-1+Tween 80: χ2=63.070, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsGFP+Tween 80: χ2=65.474, p<0.001). GFP-treated termites contaminated with fungus showed significantly decreased survival compared to the termites without fungal contamination (dsGFP+fungus versus dsDicer-1+Tween 80: χ2=58.636, p<0.001; dsGFP+fungus versus dsGFP+Tween 80: χ2=68.849, p<0.001). There was no significant difference between dsDicer-1- and dsGFP-treated termites without fungal contamination (χ2=2.037, p=0.154) (Fig. 6A). Additionally, the survival of fungus-contaminated termites treated with the miR- 71-5 simulant was signifcantly decreased compared to that of other treated termites (miR-71-5+fungus vs. control+fungus: χ2=63.593, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. miR- 71–5+Tween 80: χ2=60.585, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. control+Tween 80: χ2=67.129, p<0.001). The survival of fungus-contaminated termites treated with the simulant control was significantly decreased compared to that of the termites without fungal contamination (control+fungus vs. miR-71-5+Tween 80: χ2=61.065, p<0.001; control+fungus vs. control+Tween 80: χ2=68.064, p<0.001). There was no significant difference in survival between termites treated with the miR-71-5 simulant and simulant control without fungal contamination (miR-71-5+Tween 80 vs. control+Tween 80: χ2=1.000, p=0.317) (Fig. 6B). These results suggested a good effect of miRNAs coupled with entomopathogens in biologically controlling termites.

Discusión

Los miARN realizan múltiples funciones, como regular el metabolismo energético y de carbohidratos, la respuesta inmune, reacciones de oxidación-reducción y otros procesos vitales en cuerpos completos de las termitas. Como se esperaba, la ingestión de dsDicer-1 en termitas provocó el silenciamiento de Dicer-1 y luego redujo la concentración de miARN, lo que sugiere la inducción exitosa de la desregulación de miARN. El análisis de transcripción mostró que el silenciamiento de Dicer-1 se asoció con 32 vías KEGG y 175 términos GO. En las colonias de insectos sociales, la secreción salival puede funcionar como un desinfectante externo y operar en conjunto con el comportamiento social como la trofalaxis, el aseo y la anidación para cuidar a las crías, los compañeros de nido y las colonias (Bulmer et al. 2009; Hamilton et al. 2011). ; Hamilton y Bulmer 2012). La glucólisis, el ciclo del citrato y la generación de ATP a partir del ADP participan en el metabolismo energético y de los carbohidratos. Dado que el aumento de las respuestas inmunitarias y la realización de comportamientos sociales son energéticamente costosos, los trastornos del metabolismo energético y de los carbohidratos tienen impactos negativos en estos procesos (Liu et al. 2020; Hassan et al. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). El constituyente estructural de la cutícula se asocia con las cutículas de los insectos, formando la primera barrera para evitar que los patógenos invadan el hemocele (Syazwan et al. 2021). Varios DEG involucrados en la respuesta de defensa, la actividad de la glutatión transferasa y el proceso de oxidación-reducción pueden codificar péptidos antimicrobianos (AMP), proteínas de desintoxicación y enzimas antioxidantes para aumentar la resistencia y la tolerancia de los insectos contra los patógenos (Liu et al. 2015, 2019a). Es probable que estas funciones relacionadas con la defensa contribuyan a la inmunidad social en las colonias de termitas. El resto de las vías KEGG y los términos GO estuvieron involucrados en el sistema nervioso, el sistema digestivo, la longevidad, el desarrollo, etc. (Material complementario 2-Tabla S3 y S4). Además, algunos de los DEG (por ejemplo, genes del metabolismo energético y de carbohidratos) en las termitas silenciadas de Dicer-1 provenían de microbios (material complementario 2-Tabla S2), que posiblemente eran simbiontes intestinales y podrían ser componentes importantes. participando en los procesos vitales de los huéspedes. Por lo tanto, es probable que los miARN tengan un impacto global en todo el cuerpo de la termita.

Fig. 6 Efecto de la desregulación de miARN en la supervivencia de grupos de termitas contaminados con hongos. Una supervivencia de termitas silenciadas con Dicer- 1- versus termitas tratadas con GFP con o sin contaminación fúngica; B Supervivencia de miR-71-5 versus termitas de control tratadas con simulante con o sin contaminación fúngica. Letras diferentes indican diferencias significativas, p<0.05

El metabolismo energético y de carbohidratos, la respuesta inmune y las reacciones de oxidación-reducción son importantes para que los miARN impulsen la inmunidad social. El comportamiento animal es un proceso dependiente de la energía y, por lo tanto, algunos inhibidores de energía hacen que los animales se muevan lentamente e incluso mueran (Davidson 1930; Schuler y Casida 2001). En las colonias de termitas, los trastornos de la glucólisis o del ciclo del citrato provocan una disminución de los niveles de ATP e inhiben el comportamiento de locomoción (Hassan et al. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). Los trastornos del ciclo del citrato también reducen la actividad antifúngica de las termitas, lo que provoca un aumento de la infección y la mortalidad (Liu et al. 2020). Además, como se informó que los simbiontes en los intestinos de las termitas participaban en las defensas contra las enfermedades del huésped al proporcionar enzimas (Rosengaus et al. 2014) y metabolitos (Inagaki y Matsuura 2018), era probable que los trastornos metabólicos en los simbiontes intestinales redujeran la inmunocompetencia derivada de los simbiontes. y, por lo tanto, disminuyeron las defensas contra las termitas. En nuestro estudio, se verificó que ocho genes metabólicos estaban significativamente regulados a la baja, lo que sugiere trastornos de la glucólisis y del ciclo del citrato en todos los cuerpos de las termitas silenciadas por Dicer-1-. Sugerimos que el metabolismo energético y de carbohidratos mediado por miARN era un mecanismo bioquímico importante para impulsar la inmunidad social y que la interrupción de este proceso probablemente disminuiría las defensas fisiológicas y de comportamiento contra enfermedades en las colonias de termitas. El sistema inmunológico de los insectos induce una gran cantidad de moléculas efectoras para combatir los patógenos in vivo. Las defensinas son AMP compactos, ricos en cisteína y resistentes a proteasas con actividad de amplio espectro contra bacterias, hongos y otros parásitos (Weber 2021). La termicina es una defensina antifúngica específica de las termitas cuyo silenciamiento da como resultado una disminución de la actividad antifúngica y, por lo tanto, un aumento de la mortalidad de las termitas contaminadas con hongos (Hamilton y Bulmer 2012). Los sistemas antioxidantes y de desintoxicación de insectos a menudo funcionan en conjunto con el sistema inmunológico, lo que reduce efectivamente el riesgo de toxinas y ROS durante las interacciones huésped-patógeno (Syazwan et al. 2021). Las monooxigenasas del citocromo P450 son responsables de catalizar la oxidación y el metabolismo de las toxinas patógenas y producir radicales libres o ROS (Shankar y Mehendale 2014). La familia de las peroxiredoxinas incluye enzimas antioxidantes que catalizan la reducción de ROS (Xu et al. 2021a; b). Nuestros resultados verificaron que el silenciamiento de Dicer-1 alteró significativamente la expresión genética de defensina, tricina, citocromo P450 9e2 y peroxiredoxina-4, lo que indica que los miRNA desempeñaron papeles importantes en la regulación de la respuesta inmune y reacciones de oxidación-reducción en todo el cuerpo de la termita. Por lo tanto, sugerimos que el metabolismo energético y de carbohidratos, la respuesta inmune y las reacciones de oxidación-reducción pueden participar en el mecanismo impulsor de la inmunidad social en forma de miARN, y su alteración puede afectar negativamente la inmunidad social en las colonias de termitas.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

De hecho, la desregulación de los miARN tiene impactos negativos sobre el movimiento y, por tanto, la defensa conductual en las colonias de termitas. A diferencia de los insectos solitarios, los insectos sociales han desarrollado un rico repertorio de defensas conductuales, detectando colectivamente la presencia de patógenos, limitando la propagación de patógenos y reduciendo el riesgo de infección de los individuos (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. 2019a). Los trabajadores de mayor edad realizan tareas peligrosas fuera del nido y se contaminan fácilmente. Cuando están contaminados, los compañeros de nido tienden a unirse y acicalar a los trabajadores contaminados (Liu et al. 2019b). Tanto los trabajadores contaminados como sus cuidadores aumentan la distancia con el resto de los ingenuos compañeros de nido. Las enfermeras llevan las crías a las profundidades de la colonia para aumentar la distancia de los trabajadores contaminados (Stroeymeyt et al. 2018). Estos resultados muestran que un aumento en la distancia física entre los miembros de la colonia es una estrategia eficaz para limitar la transmisión de patógenos [denominada 'inmunidad organizacional' (Liu et al. 2019a)], y la locomoción debería ser un comportamiento social importante, ya que ajusta adaptativamente la distancia entre individuos contaminados y compañeros de nido ingenuos. Hassan y sus colegas descubrieron que las termitas mejoraron significativamente su locomoción durante la contaminación por hongos, lo que demuestra aún más la locomoción en respuesta a patógenos (Hassan et al. 2021a, b). Además, los comportamientos de acicalamiento, canibalismo y entierro son bien conocidos en el manejo de individuos y cadáveres contaminados en colonias de insectos sociales. En las termitas contaminadas con hongos, el comportamiento de acicalamiento ocurre inmediatamente, antes de la germinación (Liu et al. 2019b). Por el contrario, el comportamiento caníbal solo ocurre después de que las personas contaminadas se enferman visiblemente (Davis et al. 2018). Para el manejo de cadáveres, los cadáveres frescos a menudo se consideran recompensas nutricionales e inducen al canibalismo al producir una señal de muerte temprana. Por el contrario, los cadáveres en descomposición se consideran riesgos de infección e inducen el entierro al producir señales de muerte tardía (Sun et al. 2016). Aquí, encontramos que el silenciamiento de Dicer-1 inhibió significativamente la locomoción y otros movimientos, como comportamientos de acicalamiento, canibalismo y entierro, lo que sugiere que la desregulación de miARN exhibió un efecto general sobre el movimiento de las termitas y, en consecuencia, afectó las defensas conductuales contra patógenos, patógenos. compañeros de nido contaminados y cadáveres contaminados con patógenos en colonias de termitas. Para el mecanismo impulsor, el metabolismo energético y de carbohidratos mediado por miARN podría considerarse uno de los factores bioquímicos más importantes (consulte la discusión anterior). Por tanto, los miARN podrían moldear las defensas conductuales de las termitas.

La desregulación de miARN también tuvo impactos negativos en las defensas fisiológicas de las termitas. Las termitas normalmente aumentan su capacidad antifúngica mediante la regulación positiva de genes inmunes para mejorar sus defensas fisiológicas (Liu et al. 2015). Las sustancias antifúngicas derivadas de los simbiontes intestinales brindan a las termitas la capacidad de inhibir el crecimiento de hongos para mejorar sus defensas fisiológicas (Rosengaus et al. 2014). Por lo tanto, la actividad antifúngica total fue un indicador eficaz de las defensas fisiológicas de las termitas contra las enfermedades. Estudios recientes demostraron que no solo los genes inmunitarios sino también el metabolismo de los carbohidratos y los genes antioxidantes son componentes importantes que afectan la actividad antifúngica de las termitas (Liu et al. 2020; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Las termitas difamadas eran más vulnerables a la contaminación por hongos (Rosengaus et al. 2014). Aunque el aumento de las expresiones de genes inmunes como la defensina y la tricina, la desregulación de miARN mediada por Dicer-1- disminuyó la expresión del metabolismo de los carbohidratos y los genes antioxidantes dentro de las termitas o los simbiontes intestinales y, por lo tanto, redujo significativamente la actividad antifúngica total de las termitas. Además, las termitas tratadas con simulante miR-71-5 también mostraron una disminución en la actividad antifúngica total, lo que sugiere aún más el impacto negativo de la desregulación de los miARN en las defensas fisiológicas de las termitas. Además, los grupos de termitas alimentados con el simulante dsDicer-1 o miR-71-5 fueron más vulnerables a la contaminación por hongos, lo que mostró un aumento en la mortalidad por infección. Por lo tanto, los miARN podrían dar forma a la inmunidad social al impulsar las defensas contra enfermedades tanto fisiológicas como conductuales en las colonias de termitas.

Fig. 7 Mecanismos potenciales que subyacen a la inmunidad social en colonias de termitas y nuevos objetivos para el control biológico de plagas. Los miARN afectan ampliamente a todo el cuerpo de las termitas, incluido el metabolismo energético y de carbohidratos A, la respuesta inmune B, las reacciones de oxidación-reducción C, etc. Se informó que el metabolismo energético y de carbohidratos D desempeña papeles importantes en la regulación tanto del comportamiento como de la actividad antifúngica en las termitas. Por lo tanto, es probable que el metabolismo energético y de carbohidratos mediado por miARN sea uno de los factores genéticos y bioquímicos que impulsan las defensas contra enfermedades conductuales (como la locomoción, el aseo, el canibalismo y el entierro) y fisiológicas (actividad antifúngica) en las colonias de termitas. E La respuesta inmune ayudó a las termitas a inhibir la replicación y diseminación de patógenos en la cavidad corporal. La reacción de oxidación-reducción protegió a las termitas del daño causado por las toxinas y las ROS de las interacciones "huésped-patógeno". Por lo tanto, la respuesta inmune mediada por miARN y la reacción de oxidación-reducción desempeñan un papel importante en el impulso de la defensa fisiológica contra enfermedades en las termitas. Los miARN F dieron forma a la inmunidad social al impulsar las defensas fisiológicas y de comportamiento contra enfermedades en colonias de termitas. Al apuntar a los miARN, podríamos aumentar artificialmente la susceptibilidad de las colonias de termitas a los entomopatógenos y, en consecuencia, mejorar el control biológico de las termitas..

Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre el mecanismo potencial de los miARN subyacentes a la inmunidad social en colonias de termitas. Los miARN pueden afectar la secreción salival, el metabolismo de los carbohidratos y la energía, la generación de cutículas, las respuestas inmunitarias, las reacciones de oxidación-reducción, etc. Entre ellos, el metabolismo de los carbohidratos y la energía es probablemente un factor bioquímico importante para impulsar las defensas conductuales como la locomoción, el aseo, el canibalismo, y entierro en colonias de termitas. Además, es probable que el metabolismo energético y de carbohidratos, la respuesta inmune y las reacciones de oxidación-reducción participen en el impulso de las defensas fisiológicas de las termitas, como la actividad antifúngica.

Por tanto, la inmunidad social en forma de miARN puede influir en la susceptibilidad de las colonias de termitas a los hongos entomopatógenos; por lo tanto, los miARN pueden ser objetivos eficaces para el control biológico de las termitas (Fig. 7). Numerosos estudios han demostrado que el silenciamiento de genes diana mediado por ARNi podría provocar la muerte de insectos, con un potencial considerable para el control de plagas de insectos. En el control de plagas de termitas, Zhou et al. (2008) se dirigieron por primera vez a los genes de la endoglucanasa y los hexámeros mediante la alimentación con ARNbc, demostrando la viabilidad de los termiticidas basados ​​en ARNi. Para mejorar el efecto letal en las colonias de termitas, se han empleado termiticidas basados ​​en ARNi junto con hongos entomopatógenos infecciosos. El silenciamiento mediado por ARNi de tricina, GNBP2, TG, IDH y otros genes codificantes acoplados con Metarhizium podría aumentar significativamente la susceptibilidad de los compañeros de nido a los conidios fúngicos transferidos socialmente y, por lo tanto, conducir a una mayor tasa de mortalidad por infección (Hamilton y Bulmer 2012; Liu et al. . 2020; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). En nuestro estudio, demostramos la viabilidad de apuntar a pequeños ARN no codificantes mediante la alimentación para optimizar el control biológico de las termitas utilizando Metarhizium. En comparación con los ARNds que se dirigen específicamente a un gen, los miARN pudieron apuntar a varios genes con funciones iguales o diferentes, por lo que tuvieron un impacto de amplio espectro en los procesos vitales de las termitas. Por lo tanto, al atacar los miARN, los grupos de termitas mostraron una disminución de las defensas fisiológicas y de comportamiento contra enfermedades tanto a nivel grupal como individual, lo que sugiere una inhibición de amplio espectro de la inmunidad social de las termitas. Al atacar los miARN, los grupos de termitas mostraron en consecuencia un alto nivel de mortalidad durante la contaminación por hongos, lo que sugiere que los miARN podrían emplearse como termiticidas para mejorar el control biológico de las termitas al disminuir su inmunidad social. Por lo tanto, los miARN podrían considerarse nuevos objetivos potenciales para el control de plagas de insectos.

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