El sitio de vulnerabilidad en el pico de SARS-CoV-2 induce un anticuerpo ampliamente protector contra subvariantes de Omicron antigénicamente distintas

La rápida evolución de las variantes Omicron del coronavirus 2 (SARS-CoV{2}}) de la neumonía asiática ha enfatizado la necesidad de identificar anticuerpos con amplias capacidades neutralizantes para informar futuras terapias monoclonales y estrategias de vacunación. En este documento, identificamos S728-1157, un anticuerpo ampliamente neutralizante (bnAb) dirigido al sitio de unión al receptor (RBS) que se derivó de un individuo previamente infectado con WT SARS-CoV-2 antes de la propagación de variantes preocupantes (COV). S728-1157 demostró una amplia neutralización cruzada de todas las variantes dominantes, incluidas D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu y Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Además, S728-1157 protegió a los hámsteres contra desafíos in vivo con los virus WT, Delta y BA.1. El análisis estructural mostró que este anticuerpo se dirige a un epítopo de clase 1/RBS-A en el dominio de unión al receptor a través de múltiples interacciones hidrofóbicas y polares con su región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (CDR-H3), además de motivos comunes en CDR-H1/ CDR-H2 de anticuerpos de clase 1/RBS-A. Es importante destacar que este epítopo era más fácilmente accesible en estado abierto y de prefusión, o en las construcciones de punta estabilizadas con hexaprolina (6P), en comparación con las construcciones de diprolina (2P). En general, S728-1157 demuestra un amplio potencial terapéutico y puede servir de base para diseños de vacunas dirigidas contra futuras variantes del SARS-CoV-2.

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Introducción

Desde el inicio de la pandemia en diciembre de 2019, el virus del síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha provocado más de 660 millones de casos de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) y más de 6,5 millones de muertes en todo el mundo. Aunque el rápido desarrollo y distribución de vacunas y terapias han frenado en gran medida el efecto de la COVID-19, la aparición de variantes circulantes preocupantes (COV) sigue representando una amenaza importante debido al potencial de una mayor evasión inmune. y patogenicidad mejorada. La variante D614G fue la primera variante que surgió y a partir de entonces se volvió universalmente prevalente. En comparación con la WT, la variante D614G mostró una mayor transmisibilidad en lugar de una mayor patogenicidad y, por lo tanto, era poco probable que redujera la eficacia de las vacunas en los ensayos clínicos (1). Entre la aparición de D614G y octubre de 2021, evolucionaron cuatro COV importantes adicionales en todo el mundo, incluidos Alfa, Beta, Gamma y Delta. Entre estas variantes, Delta se convirtió en una grave amenaza global debido a su transmisibilidad, mayor gravedad de la enfermedad y evasión inmune parcial, como lo demuestra la capacidad reducida del suero policlonal y los mAb para neutralizar esta cepa (2–6). Poco después, en noviembre de 2021, la variante Omicron fue identificada y anunciada como un nuevo COV. Esta variante poseía el mayor número de mutaciones hasta la fecha y parecía propagarse más rápidamente que las cepas anteriores (7, 8). Actualmente, existe una amplia gama de sublinajes de Omicron que conducen a nuevos casos de COVID-19, siendo BQ.1, BQ.1.1 y XBB.1.5 dominantes sobre BA.5 y representando la mayoría de los casos nuevos en todo el mundo en ese momento. de escritura. Las variantes de Omicron pueden escapar al reconocimiento de la inmunidad asociada a la vacuna COVID-19 en diversos grados, reduciendo así significativamente la potencia neutralizante de los anticuerpos séricos de individuos convalecientes, completamente vacunados con ARNm y de individuos reforzados con el nuevo bivalente WT/BA.5. Vacuna de ARNm (9, 10). De manera similar, las variantes de Omicron pudieron escapar de la unión de varios mAb terapéuticos con autorización de uso de emergencia (EUA), a pesar de que previamente se había demostrado que eran eficaces contra COV anteriores (10-12). Debido a la menor neutralización contra Omicron y la amenaza continua de futuros COV, existe una necesidad urgente de identificar anticuerpos neutralizantes amplios y potentes que puedan proteger contra linajes diversos y en evolución de SARS-CoV-2. En este estudio, identificamos un potente mAb reactivo al dominio de unión al receptor (RBD-reactivo) de la sangre periférica de un individuo convaleciente de SARS-CoV-2 que neutralizó eficazmente Alfa, Beta, Kappa, Delta, Mu, y variantes Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 y XBB). Este mAb, S728-1157, redujo significativamente las cargas virales BA.1 Omicron, Delta y WT en los pulmones y la mucosa nasal después de la exposición in vivo en hámsteres. S728-1157 se une al sitio de unión al receptor (RBS) que está completamente expuesto cuando el RBD en la espiga está en la conformación hacia arriba. El mAb utiliza motivos encontrados en CDR-H1 y CDR-H2 que son comunes a los anticuerpos IGHV3-53/3-66 clase 1/RBS-A (13, 14), pero también a través de amplios contactos únicos con CDR. -H3 para evitar mutaciones en los picos de COV. Esto sugiere que el diseño racional de futuros refuerzos de vacunas que cubran las variantes de Omicron debería modificarse para presentar un pico estabilizado en la configuración mayoritariamente ascendente para inducir de manera óptima mAb de clase 1/RBS-A que tengan características CDR-H3 similares.

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Resultados

Aislamiento de mAb reactivos a RBD que exhiben diversos patrones de neutralización y potencia. Antes de la propagación de los linajes Omicron, previamente caracterizamos 43 mAb dirigidos a distintos epítopos en la proteína de pico, incluido el dominio N-terminal (NTD), RBD y la subunidad 2 (S2). Ninguno de estos anticuerpos pudo neutralizar las variantes del SARS-CoV-2 que circulaban en ese momento (15). En este estudio, se expresó un panel adicional de mAb reactivos a RBD de 3 individuos con alta respuesta que generaron respuestas sólidas de IgG anti-pico, como se definió anteriormente (16) (Tablas complementarias 1 y 3; material complementario disponible en línea con este artículo; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Aunque la proporción de células B que se unen a RBD fue similar en los pacientes con alta respuesta en comparación con los de respuesta media y baja (Figura 1, A-C), las tasas de hipermutación somática de cadena pesada fueron significativamente mayores en el grupo de respuesta alta (Figura 1). , D y E), lo que sugiere que estos individuos pueden tener el mayor potencial para generar mAb potentes con reacción cruzada (16). Estos anticuerpos se investigaron más a fondo contra mutantes de RBD para identificar sus clasificaciones de epítopos (17). Entre 14 mAb reactivos con RBD, identificamos 4 mAb de clase 2, 2 mAb de clase 3 y 8 mAb no clasificados que mostraron poca o ninguna reducción en la unión contra cualquier mutante clave de RBD probado (Figura 1F). Cabe señalar que los anticuerpos de clase 2, clase 3 y clase 4 corresponden aproximadamente a los epítopos RBS BD, S309 y CR3022 definidos en estudios previos (13, 18). Los mAb de RBD de clases 2 y 3 no reconocieron un mutante de RBD multivariante que contenía sustituciones K417N/E484K/L452R/N501Y, un RBD diseñado artificialmente para incluir mutaciones clave para el escape del virus (17, 18), ni demostraron ninguna reactividad cruzada con el RBD de SARS-CoV-1 y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV (Figura 1F). Funcionalmente, los mAb RBD de clase 2 y 3 neutralizaron potentemente las variantes D614G y Delta, pero la actividad neutralizante fue más limitada contra Beta, Kappa y Mu (Figura 1G). Ninguno de los anticuerpos de clase 2 o 3 analizados neutralizó ninguna variante de Omicron analizada.

Por el contrario, la mayoría de los mAb no clasificados se unieron al RBD multivariante y reaccionaron de forma cruzada con el RBD del SARS-CoV-1 (Figura 1F). Entre estos, identificamos 3 mAb, S451-1140, S626-161 y S728-1157, que mostraron una alta potencia de neutralización contra D614G y Beta, Delta, Kappa, Mu y Omicron BA.1 con una concentración inhibidora del 99 % (IC99) en el rango de 20 a 2500 ng/ml (Figura 1G). Dada la amplia potencia de neutralización de estos 3 mAb, además de la plataforma de ensayo de placa, también realizamos la actividad de neutralización contra BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, Virus BA.5 y XBB mediante la prueba de neutralización de reducción de foco (FRNT) (Figura 1G). De estos, S728-1157 mostró altas actividades neutralizantes contra el panel de variantes de Omicron, incluidas BA.1, BA.2, BA.4 y BA.5, con un IC99 de hasta 100 ng/ml medido por un ensayo de placa. Se observó un escenario similar usando FRNT, donde S728-1157 mantuvo su alta actividad de neutralización contra BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 y XBB con un IC50 en el rango de 8 a 300 ng. /mL (Figura 1G). S451-1140 neutralizó potentemente BA.1, BA.2, BA.2.75 y BL.1, pero no BA.4 y BA.5, como se observó en ambas plataformas de ensayo de neutralización. Por otro lado, S626-161 no demostró actividad neutralizante contra variantes de Omicron más allá de la variante BA.1 (Figura 1G). Aunque S626-161 tenía una potencia de neutralización más baja contra los COV probados que los otros 2 anticuerpos, fue el único mAb que mostró reactividad cruzada no solo con el SARS CoV-1 RBD sino que también fue capaz de neutralizar a los murciélagos. coronavirus WIV-1 y RsSHC014 (Figura 1, F y G). Estos datos sugieren que S626-161 reconoce un epítopo conservado que se comparte entre estos linajes de arbovirus pero que está ausente en BA.2 y cepas posteriores. Además, en comparación con S728-1157 y S451-1140, S626-161 tiene una CDR-H3 más larga que podría proporcionar una capacidad mejorada para reconocer un parche altamente conservado de residuos compartidos entre arbovirus, como se describe en un estudio anterior (19) (Figura 1 complementaria). Al comparar los genes variables de inmunoglobulina pesada (IGHV) y de cadena ligera (IGLV o IGKV) de estos 3 mAb con la base de datos disponible de mAb neutralizantes del SARS-CoV-2 (13, 15, 20–27), encontramos que la cadena pesada Los genes variables utilizados por S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) y S626-161 (IGHV4-39) tienen Se ha informado anteriormente que codifica varios anticuerpos potentemente neutralizantes del SARS-CoV-2 dirigidos al RBD (21, 22, 28, 29). Sin embargo, solo S728-1157 tenía pares únicos de genes variables de cadena pesada y ligera que no se han informado en la base de datos (Tabla complementaria 3), lo que indica que no es un clonotipo público.

Figura 1. Caracterización de mAb reactivos a RBD aislados de individuos convalecientes de COVID-19

Estos 3 mAb (S451-1140, S626-161 y S728-1157) se caracterizaron adicionalmente para determinar su amplitud de unión contra los COV del SARSCoV-2 (Figura 2, A y B). . Se ha demostrado que la espiga estabilizada por prefusión que contiene 2-sustituciones de prolina en la subunidad S2 (2P; diprolina) es un inmunógeno superior en comparación con la espiga WT y es la base de varios SARS-CoV actuales-2 vacunas, incluidas las basadas en ARNm (30, 31). Más recientemente, se informó que la proteína de pico estabilizada con 6 prolinas (6P; hexaprolina) aumenta la expresión y es incluso más estable que la construcción de diprolina original; como resultado, se ha propuesto su uso en la próxima generación de vacunas contra la COVID-19 (32, 33). Para determinar si existen diferencias de antigenicidad entre las construcciones de picos de diprolina y hexaprolina, se incluyeron ambos inmunógenos en nuestro panel de prueba. Según lo medido por ELISA, encontramos que 3 mAb se unían al antígeno de pico 6P-WT en mayor medida en comparación con el pico WT-2P (Figura 2, A y B). Los 3 mAb mostraron una unión comparable a los picos de los virus Alfa, Beta, Gamma y Delta, en relación con la de WT-2P (Figura 2, A y B). Sin embargo, las reactividades de unión de estos 3 mAb se redujeron sustancialmente contra un panel de antígenos de la familia Omicron (Figura 2, B y C). La unión de S451-1140 fue sensible a las mutaciones encontradas en BA.1 y BA.2, lo que resultó en una gran disminución en la unión y una disminución 31-veces en la neutralización contra estas variantes en comparación con WT-2 Antígeno P y virus D614G, respectivamente (Figura 2B). El mAb neutralizante cruzado de sarbecovirus, S626-161, también mostró una unión reducida de 1,2- a 3,5- veces al antígeno Spike BA.1, lo que puede explicar un {{45} } reducción de veces en la actividad de neutralización contra BA.1 (Figura 1G y Figura 2, B y C). Para el anticuerpo ampliamente neutralizante (bnAb) más potente, S728-1157, la unión a los antígenos Omicron se redujo en menor medida (entre 1,{51}} y 4,4-veces) en comparación con WT-2P aumentó y no se vio afectado en la actividad neutralizante (Figura 1G y Figura 2, B y C). La disminución sustancial en la unión del mAb neutralizante de Omicron al pico BA.1 puede deberse a alteraciones en su movilidad y estar relacionada con el apretado empaquetado de las estructuras de Omicron 3-RBD-down y la preferencia por 1- hasta RBD que ayudan a evadir anticuerpos, según lo informado por un estudio anterior (34). Las mutaciones estabilizadoras 2P y 6P también tienen efectos diferenciales en las variantes de Omicron, donde los 3 mAb mostraron una unión 2,8-veces mayor al pico BA.1-6P en comparación con el BA.1-2P versión, pero solo aumentó marginalmente la unión a las versiones Spike BA.2 y BA.4/5 6P en comparación con sus versiones 2P entre 1,2 × y 1,4 ×, lo que sugiere una accesibilidad ligeramente mejor de los mAb neutralizantes de Omicron a las versiones hexapolo. especialmente para la construcción Spike BA.1. Además de ELISA, se utilizó interferometría de biocapa (BLI) para cuantificar la tasa de unión y las constantes de equilibrio (kon, koff y KD) de estos 3 mAb a un panel de antígenos de pico (Figura 2 complementaria). Las tasas de reconocimiento de la unión del antígeno del fragmento (Fab) a los picos de hexaprolina fueron de 1,{83}} a 3,3- veces más rápidas en comparación con los picos de diprolina (Figura 2 suplementaria, B y C), lo que demuestra que los anticuerpos se unieron a la construcción 6P más rápidamente que a la construcción 2P. Esto podría haberse esperado si los epítopos fueran más accesibles en el RBD en estado abierto en el pico de hexaprolina. A excepción de S626- 161, los Fabs se disociaron del pico de hexaprolina más lentamente (tenían un koff más bajo) que el pico de diprolina, de modo que el KD general mostró que S728-1157 y S451-1140 se unieron a la punta de hexaprolina con mayor afinidad (Figura complementaria 2, B y C). El aumento en la unión al pico de hexaprolina fue aún más notable para la IgG intacta según el modelo de interacción 1:2, como lo muestran los mAb S728-1157 y S451- 1140, consistente con la exposición de múltiples epítopos con estabilización 6P que permite avidez mejorada (Figura complementaria 2, A y C). En conjunto, estos resultados sugieren que los epítopos objetivo pueden ser comparativamente más accesibles en el pico estabilizado con 6P cuando el RBD está en estado abierto. A continuación se realizaron análisis estructurales para verificar esta conjetura.

Figura 2. Amplitud de unión de mAb neutralizantes de Omicron

Análisis estructural de mAbs ampliamente neutralizantes. Como una primera aproximación de los epítopos unidos, se utilizó un ensayo de competencia ELISA para determinar si estos 3 mAb ampliamente neutralizantes compartían alguna superposición con nuestro panel actual de mAb, una colección de mAb con especificidades de epítopo conocidas de estudios anteriores (15, 25, 35). y otros 2 mAb actualmente en uso clínico, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) y REGN10933 (Regeneron) (37). Los sitios de unión de S451-1140 y S728-1157 se superpusieron parcialmente con CC12.3 (23, 25), un anticuerpo neutralizante de clase 1, y la mayoría de los anticuerpos de clase 2, incluidos LY-CoV555 y REGN10933, pero no con anticuerpos de clase 3 y clase 4 (Figura 3A). S626-161 compartió una superposición notable en la región de unión con CC12.3 de clase 1, varios anticuerpos de clase 4, incluido CR3022, y otros anticuerpos no clasificados, mientras que tuvo cierta superposición parcial con varios anticuerpos de clase 2 y un solo anticuerpo de clase 3 (Figura 3A). De manera análoga, un ensayo BLI de competencia reveló que S451-1140 y S728-1157 competían fuertemente entre sí por unirse al pico WT-6P, mientras que S626-161 no lo hacía (Figura complementaria 3). En general, estos datos sugieren que S451-1140 y S728-1157 reconocen epítopos similares que son distintos de S626-161.

Figura 3. Mecanismo de neutralización amplia de S728-1157

El anticuerpo S728-1157 estaba codificado por IGHV3-66 y poseía una corta región determinante de complementariedad 3 (CDR-H3). En particular, los mAb que se unen a RBS en el modo de unión 1 (es decir, RBS-A o sitio de clase 1), tipificados por CC12.1, CC12.3, B38 y C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), tienden a usar IGHV3-53 o 3-66 y son sensibles a las mutaciones de COV (40). Sin embargo, la región CDR-H3 de S728-1157 es muy distinta de otros anticuerpos de esta clase, lo que podría explicar su actividad más amplia. Para comprender la base estructural de la neutralización amplia por S728-1157 en este epítopo, resolvimos una estructura de microscopía crioelectrónica (crio-EM) (Figura 3B) de IgG S728-1157 en complejo con pico WT{ {31}}P-Mut7, una versión del pico WT-6P que posee un enlace disulfuro interprotómero en C705 y C883, con una resolución global de aproximadamente 3,3 Å (Figura 4E complementaria). Utilizando métodos de expansión de simetría, clasificación enfocada y refinamiento, logramos una resolución local en la interfaz RBD-Fv de aproximadamente 4 Å (Figura 4E complementaria y Tabla 8 complementaria). Se determinó una estructura cristalina de S728-1157 Fab con una resolución de 3,1 Å y se utilizó para construir el modelo atómico en la interfaz RBD-Fv. Nuestras estructuras confirman que S728-1157 se une al epítopo RBS-A (o clase 1) en la conformación RBD-up (Figura 3B y Figura complementaria 4E), similar a otros IGHV3-53/{{55} } anticuerpos (Figura 3C). El bloqueo estérico del sitio de unión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) por S728-1157 explica su alta potencia de neutralización contra el SARS-CoV-2. El motivo 32NY33 y el motivo 53SGGS56 (23) en S728-1157 CDR-H1 y -H2 interactúan con el RBD casi de la misma manera que CC12.3 (Figura 4 complementaria, B y C). Sin embargo, en comparación con VH 98DF99 en CC12.3, VH 98DY99 en S728-1157 CDR-H3 forma interacciones más extensas, incluidas interacciones tanto hidrofóbicas como polares, con el RBD, lo que puede explicar la amplia neutralización contra los COV (Figura 3D y tablas complementarias 6 y 7). La diglicina VH 100GG101 en S728- 1157 CDR-H3 también puede facilitar una unión más extensa en comparación con VH Y100 en CC12.3, probablemente debido a la flexibilidad en los residuos de glicina que conducen a una conformación diferente de la punta de la CDR. -Bucle H3 y un desplazamiento relativo de residuos en 98DY99.

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Aunque los Omicron VOC tienen mutaciones extensas en el RBD, la mayoría de estos residuos no interactúan con S728-1157, ya que aún se observa unión (Figura 4A complementaria). A partir de nuestro modelo de pico WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157, se predice que Y505 a VL Q31 y E484 a VH Y99 formarán enlaces de hidrógeno (Figura 4D complementaria y Tabla 6 complementaria). ), que tienen el potencial de verse alterados por las mutaciones de Omicron Y505H y E484A. Sin embargo, una mutación Y505H aún permitiría un enlace de hidrógeno con VL Q31, y una mutación E484A agregaría otra cadena lateral hidrofóbica cerca de los residuos hidrofóbicos VL Y99, F456 e Y489. Estos contactos pueden explicar, en parte, el mecanismo que permite a S728-1157 retener la actividad neutralizante, aunque reducida, contra el antígeno pico BA.1 (Figura 1G y Figura 2B). El antígeno BA.1, a su vez, posiblemente esté relacionado con las mutaciones de Omicron que alteran el paisaje conformacional de la proteína de pico (34). Sin embargo, varios residuos somáticamente mutados, es decir, VH L27, L28, R31, F58 y VL V28 y Q31, en S728-1157 están involucrados en la interacción con SARS-CoV-2 RBD (Figura 1 suplementaria y Tabla complementaria 7), que también puede contribuir a su amplia reactividad en comparación con CC12.3. En general, nuestros estudios estructurales revelaron la base de una amplia neutralización de S728-1157 que puede adaptarse a la mayoría de las mutaciones en los COV del SARS-CoV-2.

Figura 4. Eficacia protectora de los bnAb contra la infección por SARS-CoV-2 en hámsteres.

S728-1157 reduce la replicación de SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta y WT SARS-CoV-2 en hámsteres sirios. Para evaluar la eficacia protectora de nuestros mAb ampliamente neutralizantes, utilizamos un modelo de infección de hámster sirio dorado que se ha utilizado ampliamente para el SARS-CoV-2. Los hámsteres recibieron 5 mg/kg de nuestros mAb de prueba o un control de isotipo dirigido a un antígeno irrelevante (glucoproteína del virus del ébola) mediante inyección intraperitoneal 1 día después de la infección con los virus SARS CoV-2. Se recogieron tejidos pulmonares y nasales 4 días después de la infección (Figura 4A). La administración terapéutica de S728-1157 dio como resultado títulos reducidos de las variantes WT, BA.1 Omicron y Delta tanto en los cornetes nasales como en los pulmones de hámsteres infectados (Figura 4, B-D). Curiosamente, el efecto de S728-1157 en los pulmones fue dramático, reduciendo las cargas virales de WT y BA.1 Omicron en aproximadamente 104 PFU, con los títulos virales de la variante BA.1 Omicron completamente abolidos (Figura 4C). A diferencia de la neutralización in vitro (Figura 1G), S451-1140 no redujo la replicación viral de BA.1 Omicron en los cornetes nasales y pulmonares, lo que indica una desconexión entre la neutralización in vitro y la protección in vivo para este clon (Figura 4E). . En comparación, la administración de S626-161 resultó en reducciones marginalmente significativas en los títulos virales pulmonares después del desafío WT y BA.1 (Figura 4, F y G). Estos datos subrayan que, para definir con precisión los mAb ampliamente protectores, es necesario evaluar la eficacia de la protección en paralelo con la actividad de neutralización. En el futuro, será interesante examinar hasta qué punto la capacidad protectora de S728-1157 depende de Fc. En general, S728-1157 representa un mAb prometedor con una amplia eficacia de neutralización contra las variantes de SARS CoV-2 que son capaces de reducir drásticamente la replicación de WT, Delta y BA.1 in vivo.

La infección por SARS-CoV-2 rara vez provoca mAb potentes de neutralización cruzada tipo S728-1157. Dado el potencial de neutralización cruzada y profiláctico de S728-1157, intentamos evaluar si los anticuerpos similares a S728-1157 se inducen comúnmente entre las respuestas policlonales en pacientes con SARS-CoV-2. Para evaluar esto, realizamos ELISA de competición utilizando suero de convaleciente para detectar títulos de anticuerpos anti-RBD que podrían competir por la unión con S728-1157 (Figura 5A). Los sujetos se dividieron en 3 grupos según la magnitud de las respuestas de anticuerpos, como se definió anteriormente (15, 16). Aunque los respondedores altos y moderados tuvieron títulos más altos de anticuerpos séricos competitivos S728-1157 en comparación con los respondedores bajos (Figura 5B), los títulos fueron bastante bajos en todos los grupos, lo que sugiere que es poco común adquirir niveles altos de S{{ 18}}–anticuerpos similares en suero policlonal después de una infección por WT SARS-CoV-2. Además de S728-1157, probamos la competencia del suero de convaleciente con otros mAb, incluidos S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 y CC12.3. De manera similar a S728-1157, observamos títulos relativamente bajos de anticuerpos que compiten con S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 y CC12.3 en el suero policlonal de la mayoría de los convalecientes. individuos (Figura 5, C – F y H). No obstante, los pacientes con alta respuesta tendieron a tener títulos significativamente más altos contra los mAb neutralizantes que los pacientes con baja respuesta (Figura 5, B-F y H). Por el contrario, los anticuerpos dirigidos al sitio del epítopo CR3022 fueron más pronunciados en individuos convalecientes, lo que sugiere el enriquecimiento de anticuerpos RBD de clase 4 en suero policlonal (Figura 5G). En particular, no hubo diferencias significativas en los títulos de CR3022 entre los 3 grupos de respuesta, lo que sugiere que los anticuerpos del sitio CR3022- se indujeron constantemente durante la infección por WT SARS-CoV-2 en la mayoría de los individuos. Curiosamente, en comparación con CC12.3, S728-1157 se detectó en niveles 4-veces más bajos en el suero de los pacientes con alta respuesta. Por lo tanto, a pesar de que los anticuerpos de clase 1 son frecuentemente inducidos por infección natural y vacunación (14, 20, 28, 29, 41–43), nuestros datos sugieren que los anticuerpos similares a S728–1157 que representan un subconjunto de esta clase son comparativamente raros.

Además, examinamos la diferencia en la reactividad al pico estabilizado con 2P versus 6P en los sueros de nuestra cohorte de convalecientes (Figura 5, I-K). Descubrimos que los 3 grupos de respuesta montaron anticuerpos reactivos anti-pico contra el pico WT estabilizado con 6P en mayor medida que el pico WT estabilizado con 2P, por un factor de 6 a 11 veces (Figura 5J), lo que indica que el los epítopos antigénicos principales se exhibieron o estabilizaron mejor en el antígeno estabilizado con 6P. Usando las mismas muestras, los respondedores altos y moderados también tuvieron títulos más bajos de anticuerpos anti-pico contra BA.1-2P que BA.1-6P, de 4 a 5 veces (Figura 5K). Es de destacar que los pacientes con baja respuesta tuvieron un cambio menor en la reactividad de unión contra el pico BA.1 Omicron-2P y 6P (2-reducción de veces) en comparación con el pico WT-2P y 6P ({ {28}}veces) (Figura 5, J y K), lo que sugiere que los anticuerpos séricos contra los epítopos reactivos con ómicrones BA.1 pueden ser más limitados en sujetos con baja respuesta. En general, estos datos sugieren que existe una unión policlonal mejorada inducida por la infección natural a la espiga estabilizada con 6P, tanto para los virus WT como para los Omicron.

Los anticuerpos similares a S728-1157 se inducen de manera óptima en el contexto de la inmunidad híbrida. La infección primaria por SARS-CoV-2 sin vacunación se ha vuelto poco común en el entorno global actual, y varios estudios han informado que la inmunidad al SARS-CoV-2 difiere entre personas con antecedentes específicos de vacunación/infección. Como resultado, a continuación intentamos investigar qué exposiciones comunes, aparte de la infección WT solo con SARS-CoV-2 ancestral, inducirían eficazmente anticuerpos similares a S728-1157 en plasma de vacunados monovalentes basados ​​en ARNm con y sin experiencia previa. infección. Obtuvimos la muestra biológica necesaria de la cohorte del estudio Protección asociada con la inmunidad rápida al SARS-CoV-2 (PARIS), que ha seguido longitudinalmente a los trabajadores de la salud desde el comienzo de la pandemia (44). Seleccionamos muestras de plasma de participantes del estudio completamente inmunizados (2 × vacunados) con y sin infección, así como de participantes reforzados (3 × vacunados) con y sin infección. Además, también incluimos muestras de participantes del estudio que habían recibido la vacuna bivalente de ARNm (ancestral WA1/2020 más Omicron BA.5) (Figura 6A y Tabla complementaria 2). Las infecciones irruptivas en los participantes que habían recibido vacunas de refuerzo se produjeron en un momento en que los linajes de Omicron habían desplazado a todos los demás linajes de SARS-CoV-2 en el área metropolitana de Nueva York. Descubrimos que los individuos con doble vacunación tenían los títulos más bajos de anticuerpos séricos competitivos S728-1157 entre los 5 grupos de muestras analizadas (Figura 6B). En particular, estos niveles fueron similares a los observados en nuestra cohorte de convalecientes no vacunados (todos los que respondieron; Figura 5B). En comparación, las personas con antecedentes de infección natural, incluidas las personas convalecientes que recibieron 2 de 3 dosis de vacuna y las personas que habían experimentado una infección irruptiva y recibieron un refuerzo bivalente, mostraron niveles significativamente más altos de obtención de S728-1157 en comparación con los no infectados. pero individuos vacunados (Figura 6B). Aunque el grupo de dosis 3-no infectado mostró solo un aumento no significativo en comparación con el grupo de dosis 2-, el desglose pareado por tipo de vacuna indicó que terceras dosis homólogas de BNT162b2 y ARNm-1273 aumentaron significativamente S{{ 38}}como títulos de anticuerpos neutralizantes en 2,72 × y 2,85 ×, respectivamente (Figura 6, C y D). Cabe señalar que entre los participantes con 3 contactos totales con pico por cualquier medio, los títulos de anticuerpos similares a S728-1157-fueron 3 veces más altos en los convalecientes con doble vacuna en comparación con los con triple vacuna sin infección previa, lo que sugiere que el SARS-CoV{{ 51}} la infección induce de manera más óptima este clonotipo. Entre los grupos de inmunidad híbrida, observamos que la mayoría de los individuos reforzados con avance que recibieron la dosis de refuerzo bivalente tenían títulos de anticuerpos S728-1157 sólo marginalmente más altos en comparación con los grupos vacunados con convalecientes pre omicrones, lo que sugiere que la S{{53 }} el título probablemente se estaba acercando a una meseta después de 3 exposiciones. También investigamos los títulos de anticuerpos policlonales que competían con CC12.3 y CR3022 además de S728-1157. Todos los individuos exhibieron títulos relativamente altos de anticuerpos similares a CC12.3- y CR3022-, independientemente del número y tipo de exposiciones (Figura 5 complementaria), al contrario de lo que observamos para S728-1157- como anticuerpos. En general, estos datos indican que la infección por SARS-CoV-2 y la vacunación con ARNm contribuyen a la inducción de anticuerpos similares a S728-1157-, y la infección desempeña un papel más dominante en los individuos vacunados.

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Finalmente, al comparar las respuestas contra el pico estabilizado con 2P versus 6P en la cohorte de vacunación con ARNm, encontramos que la mayoría de los grupos provocaron niveles similares de anticuerpos contra ambas construcciones. La excepción a esto fue el grupo no infectado triplemente vacunado, que demostró una reactividad estadísticamente mayor, aunque sólo ligeramente mayor, al 2P en comparación con el pico estabilizado con 6P (Figura 6E). Estos datos sugieren que, a diferencia de la infección natural (Figura 5, J y K), la vacunación por sí sola produce una respuesta policlonal que está más restringida a los epítopos en la construcción Spike-2P, en línea con la construcción Spike{{12). }}P formulación de las vacunas actuales. En última instancia, estos hallazgos respaldan la idea de que la estabilización con 6P de futuras vacunas contra el SARS-CoV-2 podría ser de gran beneficio para inducir clonotipos de anticuerpos ampliamente protectores como el S728-1157.

Figura 5. Competencia de anticuerpos séricos de convalecientes con mAb reactivos a RBD ampliamente neutralizantes y comparación de la respuesta de anticuerpos séricos contra picos estabilizados con 6P versus 2P

Figura 6. Competencia de anticuerpos séricos vacunados con ARNm con mAb reactivos a RBD neutralizantes con S728-1157 y comparación de la respuesta de anticuerpos séricos contra picos estabilizados con 6P versus 2P.

Discusión

En este estudio, identificamos un potente bnAb aislado de una célula B de memoria de un individuo que se había recuperado de la infección por SARS-CoV-2 durante la ola inicial de la pandemia de COVID-19. Este bnAb, S728- 1157, mantuvo una reactividad de unión sustancial y tuvo una actividad neutralizante constante contra todos los COV del SARS-CoV-2 analizados, incluidos Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 y XBB, y pudo reducir sustancialmente los títulos virales infecciosos después de la infección por Delta y BA.1 en hámsteres.

Descubrimos que el suero de convalecientes de nuestra cohorte contenía bajas concentraciones de anticuerpos que compiten con S728-1157 (un anticuerpo de clase 1/RBS-A) y los mAb de epítopo de clase 2. Esto sugiere que S728-1157 es algo único de otros anticuerpos que se dirigen a epítopos de clase 1 y con poca frecuencia se induce en el conjunto de células B de memoria específicas de RBD. En cambio, nuestra cohorte de infección natural pareció inducir anticuerpos dirigidos al epítopo CR3022 (clase 4); Los anticuerpos de esta especificidad a menudo tienen reactividad cruzada pero son menos potentemente neutralizantes que los anticuerpos dirigidos a RBS (14, 17). Estos datos son complementarios a nuestros hallazgos anteriores que demuestran que una abundancia de anticuerpos de clase 3/S309 en sueros de convalecientes puede contribuir a la actividad neutralizante contra las variantes Alfa y Gamma, mientras que la falta de anticuerpos de clase 2 puede explicar una capacidad de neutralización reducida contra Delta (15). . No obstante, se informa que la amplitud de la actividad de la mayoría de estos anticuerpos dirigidos a RBS (RBS-A/clase 1, RBS-B, C/clase 2 y RBS-D, S309/clase 3) contra las variantes de Omicron es muy limitada. (11, 40, 45).

El desafío clave en el futuro será determinar cómo mejorar la obtención de anticuerpos con reacción cruzada amplia contra epítopos conservados de RBS. En este sentido, observamos aquí que los individuos con inmunidad híbrida produjeron títulos significativamente más altos de anticuerpos similares a S728-1157-que los individuos vacunados sin infección previa. Es importante destacar que este fenómeno se observó incluso cuando se controló el número de exposiciones (es decir, en personas convalecientes con doble vacuna versus personas con triple vacuna no infectadas), lo que sugiere que algún elemento de la inmunidad asociada a la infección (o una formulación de vacuna que pueda imitar este tipo de inmunidad) es importante para la obtención de este clonotipo. Esto es consistente con la evidencia experimental que documenta que los individuos con inmunidad híbrida tienen perfiles de reactividad de anticuerpos más amplios en comparación con aquellos que solo tienen respuestas inmunes inducidas por vacunación o infección primaria (9).

Las estructuras aquí ilustradas ilustran que S728-1157 se une al epítopo RBS-A/clase 1 en el RBD de conformación mejorada. Este epítopo parece ser más fácilmente accesible en los picos estabilizados con 6P, que se ha informado que presentan 2 RBD en el norte del estado, en comparación con los picos 2P, que presentan solo 1 (30, 33, 46, 47), y contra los cuales nuestros anticuerpos específicos para picos de conformación ascendente muestran una unión mejorada. S728-1157 se aisló después de una infección natural; en tales contextos, las probabilidades de inducir clones similares a S728-1157 son probablemente mayores dado que el RBD debe poder adoptar una conformación positiva, incluso transitoriamente, para unirse a ACE2, exponiendo así este epítopo. A diferencia de la mayoría de los anticuerpos IGHV3-53/3-66 RBS-A/clase 1, S728-1157 puede acomodar mutaciones clave en picos de COV mediante interacciones extensas entre CDR-H3 y RBD (29, 48–50). S728-1157 también utiliza una cadena ligera diferente (IGLV3-9) en comparación con otros anticuerpos menos amplios como CC12.3 (IGKV3-20), que puede afectar las interacciones de unión generales; sin embargo, nuestro análisis indica que hay menos enlaces de hidrógeno entre la cadena ligera S728-1157 y el RBD en comparación con CC12.3 (Tabla complementaria 7). Aunque la mayoría de los residuos de contacto de CDR-H3 críticos para la reactividad cruzada de VOC en esta interacción están codificados en la línea germinal y no son introducidos por mutaciones somáticas, varios residuos somáticamente mutados en regiones estructurales o CDR-H1, CDR-H2 y CDR-L1 están codificados en la línea germinal y no son introducidos por mutaciones somáticas. involucrado en la interacción con SARS-CoV-2 RBD. Por un lado, esto sugiere que las células B de memoria que codifican anticuerpos de clase IGHV3-53/66 podrían adquirir un grado similar de reactividad cruzada mediante una mayor maduración de la afinidad. Por otro lado, esto también indica la posibilidad de diseñar inmunógenos dirigidos a la línea germinal que se dirijan a células B vírgenes similares a S728-1157-. Si bien puede ser un desafío diseñar vacunas que puedan provocar específicamente anticuerpos similares a S728-1157 con CDR-H3 seleccionados capaces de superar las mutaciones de COV, es alentador que se observe restricción del gen IGHV en otros SARS-CoV{ potentes. {58}} estudios de mAb neutralizantes (13, 15, 20–27). Alternativamente, esto también puede ser factible mediante la inmunización iterativa con inmunógenos RBD optimizados, como se ha informado anteriormente para otros patógenos (51–55).

Aunque se han observado muchas mutaciones en el sitio antigénico RBS-A/clase 1 (18), con respecto al epítopo S728-1157, 13 de 15 residuos de contacto totales de RBD y 2 de 3 CDR-H{{9} }Los residuos de contacto de RBD unidos se conservan dentro de Omicron y todos los demás COV. Esto sugiere que la región RBD donde se encuentra el epítopo S728-1157 puede incluir residuos críticos para su función dinámica y aptitud viral y, por lo tanto, sería menos tolerante a las mutaciones y la deriva antigénica que los residuos circundantes del sitio RBS-A/clase 1. Si este es el caso, se debe reducir la tendencia de este epítopo particular a perderse a medida que evolucionan las variantes virales, lo que hace que la caracterización de S728-1157 y anticuerpos y epítopos similares sea importante para las vacunas resistentes a variantes o el desarrollo terapéutico de mAb. En resumen, nuestro estudio identifica bnAb que pueden informar el diseño de inmunógenos para vacunas contra el coronavirus a prueba de variantes de próxima generación o servir como terapias de mAb que sean resistentes a la evolución del SARS CoV-2. En particular, en términos de potencia y amplitud combinadas, S728-1157 parece ser el mejor anticuerpo de su clase aislado hasta la fecha. Dado que este anticuerpo se une más fácilmente con la estabilización 6P, se predice que será inducido preferentemente por proteínas de pico recombinantes estabilizadas con 6P o por el virus completo, lo que sugiere que la modificación con hexaprolina podría beneficiar a futuras construcciones de vacunas para proteger de manera óptima contra el futuro SARS-CoV. -2 variantes y otros arbovirus.

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Métodos

Aislamiento de anticuerpos monoclonales. Las PBMC se aislaron de filtros de leucorreducción y se congelaron como se describió anteriormente (24). Las células B se enriquecieron a partir de PBMC mediante FACS. Las células se tiñeron con CD19, CD3 y sondas de antígeno conjugadas con oligofluoróforo; Las células de interés se identificaron como CD3–CD19+ Antígeno+. Todos los mAb se generaron a partir de células clasificadas con cebo de antígeno y marcadas con oligo, identificadas mediante RNA-Seq unicelular, como se describió anteriormente (15, 24). Los datos de células B individuales generados en este estudio se depositaron en Gene Expression Omnibus: GSE171703 y GSM5231088 – GSM5231123.

Se seleccionaron células B específicas de antígeno para generar mAb en función de la intensidad de la sonda de antígeno analizada por JMP Pro 15. Los genes de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos se sintetizaron mediante Integrated DNA Technologies (IDT) y se clonaron en IgG1 humana y en cadenas ligeras κ o λ humanas. vectores de expresión mediante ensamblaje de Gibson, como se describió anteriormente (56). Las cadenas pesada y ligera del mAb correspondiente se cotransfectaron transitoriamente en células HEK293T (ATCC). Después de la transfección durante 18 horas, las células transfectadas se complementaron con sobrenadante de medio de hibridoma libre de proteínas (PFHM-II, Gibco). El sobrenadante que contenía mAb secretado se recogió el día 4 y se purificó utilizando perlas de proteína A-agarosa (Thermo Fisher Scientific) como se detalló anteriormente (56). Las secuencias de cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos bien caracterizados se derivaron del Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) y REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) y se sintetizaron como se describió anteriormente. El mAb CC12.3 (ID PDB: 6XC4) fue proporcionado por Meng Yuan en el Instituto de Investigación Scripps (San Diego, California, EE. UU.). Expresión de proteína de pico recombinante. El pico recombinante D614G SARS-CoV-2 de longitud completa (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, mutantes únicos de RBD (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493A, Q493N, N501Y, Y505A e Y505F), el mutante RBD combinado (K417N/E484K/L452R/NN501Y), el RBD del SARS-CoV-1 y el RBD del MERS-CoV se generaron internamente. Brevemente, los antígenos recombinantes se expresaron utilizando células Expi293F (Thermo Fisher Scientific). El gen de interés se clonó en un vector de expresión de mamífero (AbVec modificado internamente) y se transfectó utilizando el kit ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El sobrenadante se recogió el día 4 después de la transfección y se incubó con agarosa de ácido Ni-nitrilotriacético (Ni-NTA) (Qiagen). La purificación se llevó a cabo usando una columna de flujo por gravedad y se eluyó con tampón que contenía imidazol como se describió anteriormente (57, 58). El eluato se tamponó y se intercambió con PBS usando una unidad centrífuga Amicon (Millipore). Los picos de FL recombinantes se estabilizaron mediante mutaciones 2P de las variantes B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 y BA.4 Omicron y fueron producido en el Laboratorio Sather del Instituto de Investigación Infantil de Seattle. Los RBD K417V, N439K y E484K y el pico FL recombinante WT-2P y 6P se produjeron en el laboratorio Krammer de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. El SARS-CoV-2-6P-Mut7 y el pico BA.1-6P se diseñaron y produjeron como se describe en un estudio anterior (59). Las secuencias de proteínas y los recursos para cada antígeno se enumeran en la Tabla complementaria 4. ELISA. Se recubrieron proteínas recombinantes de pico/RBD del SARS-CoV-2 en placas de microtitulación con alto contenido de proteínas (Costar) a 2 ug/mL en PBS a 50 μL/pocillo y se mantuvieron durante la noche a 4 grados. Las placas se lavaron con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBS-T) y se bloquearon con 150 µl de PBS que contenía FBS al 20 % durante 1 hora a 37 grados. Los anticuerpos monoclonales se diluyeron en serie 3- veces a partir de 10 ug/ml en PBS y se incubaron en los pocillos durante 1 hora a 37 grados. Luego, las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo IgG antihumano de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1, 000) durante 1 hora a 37 grados. Después del lavado, se agregaron 100 μL de sustrato Super AquaBlue ELISA (eBioscience) por pocillo. La absorbancia se midió a 405 nm en un espectrofotómetro de microplacas (Bio-Rad). Los ensayos se estandarizaron utilizando el anticuerpo control S144-509 (15), con características de unión conocidas en cada placa, y las placas se revelaron hasta que la absorbancia del control alcanzó una DO de 3,0. Todos los mAb se probaron por duplicado y cada experimento se realizó dos veces.

ELISA sérico. Se recubrieron placas de microtitulación con alta unión a proteínas con antígenos de pico de SARS-CoV-2 recombinantes a 2 ug/ml en PBS durante la noche a 4 grados. Las placas se lavaron con PBS 0.0Tween al 5 % y se bloquearon con 200 μL de PBS 0.1 % de Tween + 3% leche desnatada en polvo durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las muestras de plasma se inactivaron térmicamente durante 1 hora a 56 grados antes de realizar el experimento de serología. El plasma se diluyó en serie 2- veces en PBS 0,1% Tween + 1% leche desnatada en polvo. Las placas se incubaron con diluciones de suero durante 2 horas a temperatura ambiente. Se utilizó el anticuerpo secundario de cabra anti-Ig humana conjugado con HRP diluido a 1:3,000 con PBS 0,1 % de Tween + 1 % de leche desnatada en polvo para detectar la unión de los anticuerpos. Después de 1 hora de incubación, las placas se revelaron con 100 µl de solución SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) durante 10 minutos. Luego, se usaron 50 μL de HCl 3 M para detener la reacción de desarrollo. La absorbancia se midió a 490 nm en un espectrofotómetro de microplacas (Bio-Rad). Los títulos finales se extrapolaron a partir de la curva estándar sigmoidea 4PL (donde x es log de concentración) para cada muestra. El límite de detección (LOD) se define como la media + 3 DE de la señal de OD registrada con plasma de individuos anteriores al SARS-CoV-2. Todos los cálculos se realizaron en el software GraphPad Prism (versión 9.0).

Competición ELISA. Para determinar la clasificación del epítopo diana de los mAb reactivos con RBD, se realizaron ELISA de competición utilizando otros mAb con características de unión a epítopos conocidas como mAb competidores. Los mAb de la competencia se biotinilaron utilizando EZ-Link sulfo-NHS-biotina (Thermo Fisher Scientific) durante 2 horas a temperatura ambiente. El exceso de biotina de los mAb biotinilados se eliminó con columnas de desalinización por rotación Zeba con límite de peso molecular (MWCO) de 7 k (Thermo Fisher Scientific). Las placas se recubrieron con 2 ug/ml de antígeno RBD durante la noche a 4 grados. Las placas se bloquearon con PBS–20% FBS durante 2 horas a temperatura ambiente y se añadió la dilución 2-veces de los mAb de una clase o suero indeterminado, comenzando en 20 ug/ml de mAb y una dilución 1:10 de suero. Después de la incubación del anticuerpo durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadió el mAb competidor biotinilado a una concentración dos veces mayor que su constante de disociación (KD) y se incubó durante otras 2 horas a temperatura ambiente junto con el mAb o suero que se añadió previamente. Las placas se lavaron y se incubaron con 100 µl de estreptavidina conjugada con HRP (Southern Biotech) en una dilución de 1:1,000 durante 1 hora a 37 grados. Las placas fueron reveladas con el sustrato Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Para normalizar los ensayos, se añadió el mAb biotinilado competidor a un pocillo sin mAb o suero competidores como control. Los datos se registraron cuando la absorbancia del pocillo de control alcanzó una DO de 1,0 a 1,5. Luego se calculó el porcentaje de competencia entre mAb dividiendo la DO observada de una muestra por la DO alcanzada por el control positivo, restando este valor de 1 y multiplicando por 100. Para el suero, las DO se transformaron log10 y se analizaron mediante regresión no lineal para determinar el 50 Valores de % de concentración de inhibición (IC50) utilizando el software GraphPad Prism (versión 9.0). Los datos se transformaron a Log1P y se representaron en un gráfico representativo de la dilución sérica recíproca de la CI50 de la dilución sérica que puede lograr una competencia del 50 % con el mAb competidor de interés. Todos los mAb se probaron por duplicado, cada experimento se realizó 2 veces de forma independiente y se promediaron los valores de 2 experimentos independientes.

Ensayos de placa. Se realizaron ensayos de placa con virus variantes del SARS-CoV-2 en células Vero E6/TMPRSS2 (Colección japonesa de recursos biológicos de investigación (JCRB)) (Tabla complementaria 5). Las células se cultivaron para lograr una confluencia del 90 % antes de tripsinizarlas y sembrarlas a una densidad de 3 × 104 células/pocillo en placas de 96-pocillos. Al día siguiente, se incubaron 102 UFP de la variante del SARS-CoV-2 con mAb 2-vezmente diluidos durante 1 hora. La mezcla de anticuerpo-virus se incubó con células Vero E6/TMPRSS2 durante 3 días a 37 grados. Las placas se fijaron con metanol al 20% y luego se tiñeron con una solución de violeta cristal. Las concentraciones inhibidoras completas (IC99) se calcularon utilizando el log (inhibidor) versus la respuesta normalizada (pendiente variable), realizado en GraphPad Prism (versión 9.0). Todos los mAb se probaron por duplicado y cada experimento se realizó dos veces. Prueba de neutralización de reducción de foco. Se utilizaron pruebas de neutralización por reducción de foco (FRNT) para determinar las actividades de neutralización como una plataforma adicional además del ensayo de placa. Se mezclaron diluciones en serie de suero a partir de una concentración final de 1:20 con 103 unidades de virus formadoras de focos por pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37 grados. Una muestra combinada de suero prepandémico sirvió como control. La mezcla de anticuerpo-virus se inoculó en células Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) en placas de 96-pocillos y se incubó durante 1 hora a 37 grados. A cada pocillo se añadió un volumen igual de solución de metilcelulosa. Las células se incubaron durante 16 horas a 37 grados y luego se fijaron con formalina. Después de eliminar la formalina, las células se inmunotiñeron con un mAb de ratón contra la nucleoproteína SARS-CoV-1/2 [clon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], seguido de una inmunoglobulina anti-ratón de cabra marcada con HRP (Sigma-Aldrich). Aldrich; A8924). Las células infectadas se tiñeron con TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) y luego se lavaron con agua destilada. Después del secado, los números de foco se cuantificaron utilizando un analizador ImmunoSpot S6, un software ImmunoCapture y un software BioSpot (Cellular Technology). La CI50 se calculó a partir del valor interpolado del log (inhibidor) frente a la respuesta normalizada, utilizando una regresión no lineal de pendiente variable (4 parámetros) realizada en GraphPad Prism (versión 9.0).

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