Ingesta oral de péptidos de colágeno de hueso de pollo Antienvejecimiento de la piel en ratones mediante la regulación de la degradación y la síntesis de colágeno, la inhibición de la inflamación y la activación de los lisosomas Parte 1

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Resumen:El efecto de la dieta sobre el envejecimiento de la piel se ha convertido en un interesante tema de investigación. Los estudios anteriores se han centrado principalmente en los efectos beneficiosos de los péptidos de colágeno derivados de organismos marinos en la piel envejecida cuando se administran por vía oral, mientras que los efectos beneficiosos de los péptidos de colágeno derivados de las aves de corral en la piel envejecida se han informado raramente. En este estudio, se prepararon péptidos de colágeno a partir de huesos de pollo mediante hidrólisis enzimática, y se investigó el efecto y el mecanismo de acción de los péptidos de colágeno administrados por vía oral para aliviar el envejecimiento de la piel inducido por los rayos UV combinados con D-galactosa. Los resultados mostraron que el colágeno de hueso de pollo tenía características típicas del colágeno, y los péptidos de colágeno de hueso de pollo (CP) eran principalmente péptidos de pequeño peso molecular con un peso molecular de<3000 da.="">prolongación de la vida de la cistancheLos experimentos in vivo mostraron que los CP tenían un efecto de alivio significativo en la piel envejecida, indicado por los cambios en la composición y estructura de la piel envejecida, la mejora del nivel de antioxidantes de la piel y la inhibición de la inflamación; el efecto de alivio se correlacionó positivamente con la dosis de CP. Investigaciones posteriores demostraron que los CP primero reducen el nivel de oxidación de la piel, inhiben la expresión del factor de transcripción clave AP-1 (c-Jun y c-Fos), luego activan la vía de señalización TGF-/Smad para promover la síntesis de colágeno. , inhibir la expresión de MMP-1/3 para inhibir la degradación del colágeno e inhibir la inflamación de la piel para aliviar el envejecimiento de la piel en ratones. Además, el transcriptoma de la piel encontró que los lisosomas activados después de la administración oral de CP pueden ser una vía importante para las CP en la lucha contra el envejecimiento de la piel, y es digno de más investigación. Estos resultados sugirieron que los CP podrían usarse como un componente nutricional antienvejecimiento funcional.

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Palabras clave:péptidos de colágeno; antienvejecimiento; transcriptoma de piel; síntesis de colágeno; lisosomas

1. Introducción

La era de la salud, seguir con precisión una dieta saludable, determinar el papel de la nutrición en el envejecimiento de la piel y decidir qué comer para mantener una piel joven y saludable son problemas difíciles. La piel es el órgano más grande del cuerpo, compuesto por la epidermis, la dermis y la capa subcutánea. Actúa como una barrera para proteger el cuerpo de factores externos y también desempeña un papel en la salud y la belleza[1]. El envejecimiento de la piel es un proceso complejo, que se divide en envejecimiento cronológico y fotoenvejecimiento y se ve afectado tanto por factores internos como externos. Las principales características incluyen la acumulación de daño macromolecular en la célula, la disminución de la función de las células madre (que promueven la renovación de los tejidos) y la pérdida gradual de la integridad física de la piel [2]. Los principales mecanismos moleculares que causan el envejecimiento de la piel incluyen principalmente el estrés oxidativo, el acortamiento de los telómeros, el daño del ADN, la mutación genética, la regulación del micro-ARN, la acumulación avanzada del producto final de la glicación y el envejecimiento por inflamación [3]. El fotoenvejecimiento es la hiperplasia epidérmica de la piel, la desecación y la degradación de la matriz extracelular inducida por la radiación ultravioleta.cistanche nueva zelandaLa principal causa del fotoenvejecimiento son las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas por la radiación ultravioleta que median la expresión de las metaloproteinasas de matriz (MMP) y el procolágeno tipo I a través de vías de señalización como la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). camino, lo que lleva a la degradación de la matriz extracelular (ECM) en la piel y la apoptosis de los fibroblastos [4]. En los últimos años, mantener la salud de la piel y retrasar el envejecimiento se ha vuelto popular, y encontrar ingredientes naturales como péptidos bioactivos y polifenoles con funciones antioxidantes y antienvejecimiento se ha convertido en un foco de investigación [5].

Sin embargo, el colágeno tiene un gran peso molecular y es difícil de absorber y utilizar directamente, mientras que los péptidos de colágeno de pequeño peso molecular después de la hidrólisis del colágeno tienen una actividad biológica más fuerte y una alta tasa de absorción [6]. Mientras tanto, la amplia aplicación de colágeno en alimentos, medicina, ingeniería de tejidos, cosméticos y otros campos ha hecho de los péptidos de colágeno con un peso molecular más bajo, una mayor eficiencia de absorción y una actividad biológica más fuerte un nuevo favorito en la investigación médica y de alimentos funcionales.[{{1 }}]. Los péptidos de colágeno son pequeños y contienen 2-20 residuos de aminoácidos obtenidos después de la hidrólisis del colágeno. Se utilizan como suplemento dietético para el tratamiento del envejecimiento de la piel debido a sus posibles funciones antiinflamatorias y antioxidantes y la regulación inmune y los efectos de la antioxidante y la proliferación de fibroblastos de la piel [10].

Cistanche puede antienvejecimiento

Después de la administración oral, los péptidos de colágeno se absorben en forma de pequeños péptidos y se transportan rápidamente a la sangre y, finalmente, a los riñones, la piel, las articulaciones y otros tejidos para su almacenamiento y uso. Después de 14 días, los niveles de radiactividad permanecieron altos en la piel de los ratones que habían sido alimentados con péptidos de colágeno marcados con C14-. Los péptidos de colágeno pueden ser absorbidos y utilizados casi por completo por el cuerpo, mientras que la tasa de absorción y utilización del colágeno es solo del 50-60 por ciento [6,11-13]. En los últimos años, se ha informado ampliamente que los hidrolizados de colágeno de piel de pescado, escamas de pescado, hueso de vaca, piel de vaca y piel de cerdo tienen efectos beneficiosos para aliviar el envejecimiento de la piel y han recibido una atención considerable por parte de los investigadores. Por ejemplo, los péptidos de colágeno aislados de la piel de la carpa plateada promueven la síntesis de pro-colágeno e inhiben la expresión de las proteínas AP-1, MMP-1 y MMP-3 al activar la vía TGF-/Smad para prevenir degradación del colágeno y reparación de las células de la piel fotoenvejecidas [14]. La administración oral de péptidos de colágeno bovino puede mejorar la relajación de la piel, aumentar el contenido de colágeno y la actividad de las enzimas antioxidantes, reparar la fibra de colágeno y normalizar la proporción de colágeno de la piel en ratones que envejecen [15]. Sin embargo, los péptidos de colágeno de diferentes fuentes tienen efectos diferentes. La cantidad y la estructura de los péptidos altamente activos en la sangre después de la administración oral de péptidos de colágeno dependen de la fuente de colágeno[10]. El efecto protector del péptido de colágeno extraído de la piel de las gallinas contra la lesión de fibroblastos inducida por los rayos UVA fue superior al del péptido de colágeno extraído de la piel de cerdo, vaca o tilapia, y su efecto fue equivalente al tripéptido derivado del colágeno (Gly-Pro -Hip)[16]. Las creencias religiosas y las preocupaciones por enfermedades (como la enfermedad de las vacas locas) han llevado a las personas a cambiar gradualmente la dirección del desarrollo del colágeno y sus productos de los mamíferos terrestres a las aves de corral y los organismos marinos [17]. Como principal subproducto del procesamiento avícola, el hueso de pollo es una fuente prometedora de productos de colágeno. No solo reduce el desperdicio de recursos y la contaminación ambiental, sino que también permite la utilización eficiente de los subproductos. Por lo tanto, en este estudio, utilizamos péptidos de colágeno de hueso de pollo como materia prima, con ratones desnudos tratados con D-galactosa y UV para inducir el envejecimiento de la piel, como modelo para evaluar el efecto de la administración oral del péptido de colágeno en el alivio del envejecimiento de la piel en ratones y determinar el mecanismo relevante.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales, productos químicos y animales

Las granjas avícolas de la Universidad Agrícola de Yunnan (Kunming, China) proporcionaron las gallinas usadas, que se separaron, secaron y trituraron para obtener la harina de huesos de pollo. Los kits de superperóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GSH-PX) se adquirieron de Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). Hidroxiprolina (HYP), interleucina-1 (IL-1 ), metaloproteinasa de matriz-1/3 (MMP-1/3), procolágeno tipo I y ácido hialurónico( Los kits de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) se adquirieron del Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nanjing (Nanjing, China). Se adquirieron ratones sin pelo BALB/C hembra sanos (18 ± 2 g, seis semanas de edad) de Nanjing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, China) con número de permiso: SCXK(SU)2016-0010. La pepsina y la papaína se adquirieron de Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China), y otros productos químicos eran de grado analítico. Todos los ratones se manipularon de acuerdo con las Regulaciones del cuidado de animales de laboratorio de la provincia de Yunnan y fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Agrícola de Yunnan (ID de aprobación: YAUACUC01).

2.2. Preparación de colágeno y composición de aminoácidos

The extraction and amino acid composition of chicken bone collagen followed the method described by Lieut al. [18] with slight modifications. The chicken bone powder was stirred and soaked in 0.05 M NaOH,10 percent n-hexane, and 0.25 MEDTA solution (pH 7.5) at a ratio of 1/10(m/o). At each step, the sample was treated for 36h, and the soaking solution was changed every 6h to swell the bone powder and remove non-collagen proteins, fat, and minerals from the bone powder. The sample was washed with pure water to neutrality after each step. The pre-treated chicken bone meal was mixed with 0.5 M glacial acetic acid containing 0.1 percent (w/v) pepsin at a solid-to-liquid ratio of 1:10 (wo/v) and continuously stirred and extracted at 4 degree for 48 h. It was then filtered, and the filtrate was centrifuged at 15,000×g for 15 min at4 degree . tamaño del pene cistancheEl sobrenadante se ajustó a 7,5-7,8 con una solución de NaOH y se añadió NaCl a una concentración final de 1,5 M. Después de que la mezcla se mantuvo sin perturbar durante 12 h a 4 °C para la salificación, se centrifugó el precipitado de colágeno. a 15,000xg durante 15 min a 4 grados, luego se disolvió con ácido acético 0.5 M, se dializó en agua pura, se liofilizó y el producto final fue colágeno de hueso de pollo.

La composición de aminoácidos del colágeno de hueso de pollo se determinó mediante el analizador automático de aminoácidos Sykam S433D (Munich, Alemania). Se tomó una cierta cantidad de muestra de colágeno a ensayar en un tubo sellado, se le añadió 10mL6 M HCl y se hidrolizó a 110 grados durante 24 h. El hidrolizado se concentró mediante soplado de nitrógeno y se volvió a disolver en 20 ml de tampón de ácido cítrico. Después de la microfiltración con una membrana microporosa de 0,22 μm, se tomaron 20 μL de hidrolizado para el análisis del espectro de aminoácidos. El contenido de aminoácidos en la muestra se expresó en porcentajes.

2.3. Preparación y Distribución de Peso Molecular de Péptidos de Colágeno (CP)

De acuerdo con los resultados de nuestro proceso de optimización anterior, las PC se prepararon con papaína en una proporción de enzima a sustrato de 1:40(proporción de masa). Después de ajustar el pH a 7 y la hidrólisis enzimática a 63 grados durante 5 h, la enzima se inactivó en un baño de agua hirviendo durante 15 min. El hidrolizado de enzima se desalinizó y liofilizó, se volvió a disolver en una solución de ácido fórmico al 0,1 por ciento y se centrifugó para obtener el sobrenadante. El espectrómetro de masas de alta resolución AQ Exactive HF Orbitrap-OE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.), equipado con ionización por electropulverización (ESI), se utilizó para analizar el hidrolizado de colágeno en el modo de exploración completa de 350-1800 m/z, y los resultados se recuperaron y analizaron usando Proteome Discoverer

software 2.1

2.4.Prueba con animales

Ratones BALB/sin silla hembra (n {{0}}) se mantuvieron en una habitación bajo condiciones controladas de temperatura (24±1 grado), humedad (60± 5 por ciento) y 12 h ciclo día-noche durante una semana. Se les proporcionó acceso ad libitum a alimentos y agua. Después de una semana de adaptación, los ratones se dividieron aleatoriamente en los siguientes cinco grupos (n =11 por grupo): (i). Grupo normal (N): UV no expuesto; administración oral de 0.4 ml de solución salina al día. (ii). Grupo modelo (M): exposición UV más D-galactosa (0,2 ml); administración oral de 0,4 ml de solución salina al día. (i). Grupo de péptidos de colágeno de dosis baja (LCP): exposición a los rayos UV más D-galactosa (0,2 ml); oral

administración de 0.4 mL CPs (dosis: 200 mg kg-1 peso corporal) diariamente. (iv). Grupo de péptidos de colágeno de dosis media (MCP): expuesto a UV más D-galactosa; oral

administración de 0.4 mL CPs (dosis: 500 mg:kg-1 peso corporal) diariamente.

(v). Grupo de péptidos de colágeno en dosis altas (HCP): expuesto a UV más D-galactosa; administración oral de 0.4 mL CPs (dosis: 1000 mg·kg-1 peso corporal) diariamente.

El tratamiento con D-galactosa se realizó mediante la inyección subcutánea de 0,2 ml de solución de D-galactosa al 10 por ciento en la parte posterior del cuello del ratón (dosis: 1,0g/ kg-1peso corporal) diariamente. La irradiación UV se realizó con una LÁMPARA UVA-340 de 40 W (O-panel, Cleveland, EE. UU., longitud de onda máxima: 340 nm), la distancia entre la lámpara y la parte posterior de los ratones fue de 30 cm (230 m J/ cm-), y la irradiación duró 30 min todos los días durante siete semanas (49 días). La intensidad de la radiación se midió con un radiómetro UVA365-(Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, China). Una hora después del tratamiento con D-galactosa y UV, a los ratones se les administraron 0,4 ml de CP por vía oral todos los días. Después de la última irradiación, los ratones fueron anestesiados, pesados ​​y se tomaron muestras de los tejidos para su posterior análisis.

2.5. Humedad de la piel, índice visceral y ganancia de peso corporal

La humedad de la piel se determinó mediante ISO 1442 y el índice visceral se calculó mediante la siguiente ecuación: índice visceral (g/kg)=peso visceral/peso corporal.

2.6. Estrés oxidativo, HA y contenido de HYP de la piel

Las muestras de piel se homogeneizaron con nueve veces la cantidad de solución salina normal (p/p) en un baño de hielo con un homogeneizador de tejidos (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China), y luego se centrifugaron a 2000ºC. ×g y 4 grados durante 10min. Las actividades de superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GSH-PX) y los contenidos de ácido hialurónico (HA) e hidroxiprolina (HYP) en el sobrenadante recolectado se determinaron de acuerdo con el método descrito en las instrucciones. correspondientes a los respectivos kits.

2.7. Piel Histológica

Las muestras de piel de ratón se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4 por ciento durante 24 h, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en rodajas. Las secciones de piel se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) y se observaron con un microscopio de fluorescencia frontal ECLIPSE CI-E (Nikon, Japón). El grosor de la epidermis y dermis de la piel se evaluó utilizando el software Halcon 13.0.1.1 (MVTec, Munich, Alemania).

2.8.Secuenciación del transcriptoma de piel

2.8.1. Extracción de ARN, construcción de bibliotecas y secuenciación de transcriptomas

El ARN total se extrajo de la piel de los ratones usando el RNeasy Mini Kit (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza y la concentración del ARN se verificaron utilizando el espectrofotómetro kaiaoK5500 (Kaiao, Beijing, China); La integridad del ARN se evaluó utilizando el kit de ensayo RNA Nano 6000 y el sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). El análisis de secuenciación transcripcional de cada muestra fue realizado por Biolinker Technology Company Limited (Kunming, China).polvo de cistancheBrevemente, el agrupamiento de las muestras codificadas por índice se realizó en un sistema de generación de clústeres de cBot mediante HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumina) según las instrucciones del fabricante. Después de la generación de grupos, las bibliotecas se secuenciaron en una plataforma Illumina y se generaron lecturas de extremos emparejados de 150 pb.

2.8.2. Análisis bioinformáticos de datos de secuenciación de ARN

El análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se realizó utilizando el paquete de analizador de clúster de lenguaje R. Cuando el valor de p fue inferior a 0.05, los elementos y vías enriquecidos por GO y KEGG se consideraron significativos.

2.8.3. Reacción en cadena de la transcriptasa inversa-polimerasa (qRT-PCR)

QRT-PCR se realizó como se describió anteriormente [19].

2.9.Transferencia de Wester1

De acuerdo con el método descrito por Park et al. [20], se realizó un análisis de transferencia Western (WB) para cuantificar la expresión de proteínas relacionadas con el envejecimiento de la piel en ratones. La concentración de proteína del lisado de piel en cada grupo de tratamiento se cuantificó usando el kit BCA, se separó por SDS-PAGE (gel de acrilamida al 10 por ciento), se transfirió a una membrana de PVDF, se bloqueó con leche descremada al 5 por ciento y se incubó con una cantidad adecuada de primario. anticuerpos (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 y -actina) a 4 grados durante la noche. Después de lavar con TBST, las muestras se mezclaron con anticuerpos secundarios y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se utilizó el generador de imágenes de gel de quimioluminiscencia ChemiDoc XRS plus (BioRAD, Hercules, CA, EE. UU.) para detectar proteínas específicas. Se usó el software Image ] para cuantificar la expresión de la proteína diana en cada grupo de tratamiento, y los resultados se representaron mediante los valores de densidad normalizados a la proteína -actina.

2.10.ELISA

Los niveles de expresión de MMP-1, MMP-3, procolágeno de tipo I e IL-1 en el líquido de lisis de la piel se determinaron mediante inmunoensayo ligado a enzimas. El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit.

2.11. Análisis estadístico

Todos los resultados se analizaron utilizando el software SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, EE. UU.) a través del análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba de rango múltiple de Duncan, con el nivel de significación establecido en p<0.05. originpro="" 2017="" (originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±standard="" deviation="">

3. Resultados y discusión

3.1.Composición de aminoácidos del colágeno

La composición de aminoácidos del colágeno de hueso de pollo se muestra en la Tabla 1. Gly fue el principal aminoácido en las muestras, representando casi un tercio (27,86 por ciento) del total de aminoácidos, y Hyp fue el aminoácido especial en el colágeno, que representa el 9,83 por ciento. Las principales características de las moléculas de colágeno eran las secuencias Gly-XY repetidas y la estructura única de triple hélice compuesta por tres cadenas c. Gly representó alrededor de un tercio del total de aminoácidos, X e Y a menudo eran prolina e hidroxiprolina, o podían ser cualquier residuo [21]. La composición de aminoácidos de la muestra fue similar a la del colágeno de hueso de pollo informado en estudios previos y tenía las características típicas del colágeno [22].

3.2. Distribución del peso molecular de los CP

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da(Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da,65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 por ciento). Sin embargo, la empresa alemana Gelita demostró a través de varios estudios clínicos que el efecto de los péptidos de colágeno está determinado principalmente por su grado de coincidencia con las propiedades de los péptidos de colágeno después de la degradación del colágeno humano, más que por el peso molecular de los péptidos de colágeno. Descubrieron que el producto VERISOL⑧ con un peso molecular promedio de 2000 Da tiene el efecto más estimulante sobre los fibroblastos de la piel, mientras que el producto FortigelTM con un peso molecular promedio de 3000 Da tiene un efecto especial sobre la reparación del cartílago [25-27].

3.3. Efecto de las PC orales en el alivio del envejecimiento de la piel

3.3.1. Peso Corporal e Índice de Órganos

El índice de peso corporal y el índice de órganos son importantes y reflejan el estado de salud de los ratones. El peso de los ratones en cada grupo aumentó normalmente durante el período de prueba (Tabla 2). El aumento de peso promedio del grupo M fue menor que el del grupo N, y el de los grupos de tratamiento con CP fue mayor que el del grupo M, lo que sugiere que los CP no tuvieron efectos secundarios en los ratones. En informes anteriores, la dosis de ratones tratados con péptidos de colágeno fue mayoritariamente entre 100-1000 mg/kg.bw·d, y la dosis segura de péptidos de colágeno de tilapia alcanzó los 4,07 g/kg.bw·d [{{6} }].extracto de salsa cistanche Similarly, the growth of skin-aged mice after gavage with tilapia scale collagen peptides (dose: 500 and 1000 mg/kg.bw·d)was also similar to our results [29]. The spleen plays an important role in humoral and cellular immunity, thus, the spleen index is often used to evaluate immune system function. The liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups(p>0.05). Los resultados fueron similares a los de estudios previos [30], lo que indica que las PC son seguras y podrían mejorar ligeramente la inmunidad de los ratones.

3.3.2. Composición de la piel

El tratamiento con UV y D-galactosa (grupo M) redujo significativamente el contenido de humedad, HA y Hyp en la piel, en comparación con los del grupo, en un 13,36 %, 24,08 % y 15,83 %, respectivamente (p<0.05)(table 2).the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Los cambios en el contenido de humedad de la piel provocan arrugas y flacidez de la piel y se ven afectados por los componentes de la matriz, como el colágeno de la piel y el AH[31]. La hidroxiprolina es un aminoácido especial, rico y estable en el colágeno, y su contenido puede reflejar indirectamente el contenido de colágeno en la piel, así como el envejecimiento de la piel. Además, HA, que se expresa en gran medida en la ECM de la piel, desempeña un papel importante en el control del equilibrio hídrico de la piel, la presión osmótica, la retención de humedad y la elasticidad como sistema de almacenamiento de agua y componente estructural de la piel [32]. En este estudio, el contenido de humedad, HYP y HA en la piel aumentó significativamente después de la ingesta de CP, lo que podría estar relacionado con la promoción de la síntesis de colágeno y HA por parte de las CP. Además, el aumento de HYP y HA aumentó el contenido de humedad.

3.3.3. Cambios histológicos de la piel

Los cambios histológicos en la piel de la espalda de los ratones después de siete semanas de tratamiento continuo se muestran en la Figura 2. La piel envejecida del grupo M mostró las características de superficie rugosa, epidermis engrosada, dermis adelgazada y células escasas, en comparación con la piel del grupo N. Sin embargo, la condición de la piel envejecida en ratones mejoró después de la administración oral de CP, manteniendo una estructura suave, ordenada y completa similar a la de los ratones del grupo N. Por lo tanto, la dermis de la piel era significativamente más delgada y la epidermis era significativamente más gruesa en el grupo M que en el grupo N (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).="" the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously[4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,="" loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" into="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4.Niveles de antioxidantes e inflamatorios de la piel

Determinar la actividad de las enzimas antioxidantes es el método más utilizado para evaluar el nivel de antioxidantes en el cuerpo [28]. Como se muestra en la Figura 3, las actividades del contenido de CAT, SOD, GSH-Px y MDA en el grupo M fueron significativamente más bajas que las del grupo N (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-px="" activities,="" and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activates="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrix="" collagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Además, la respuesta inflamatoria celular causada por ROS también contribuye al envejecimiento de la piel. Después del tratamiento con UV y D-galactosa (grupo M), el contenido de IL-1 en la piel de los ratones aumentó significativamente en comparación con el grupo N (Figura 3D), lo que indica que la piel mostró una respuesta inflamatoria significativa (pags<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05), indicating="" that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the="" o2="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4.Mecanismo de acción de las PC dietéticas en el alivio del envejecimiento de la piel

3.4.1.Análisis y validación de datos de RNA-Seq

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GO enrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A)and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B).The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group(Figure 4A,B).Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs, 4303 genes were significantly expressed in the mice's skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" six="" genes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes(including="" fos,="" jun,="" cxcl1,="" and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated(figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

el análisis de enriquecimiento y el análisis de enriquecimiento de la base de datos KEGG brindaron apoyo para seguir investigando las funciones biológicas de los DEG. El análisis GO mostró que los DEG se enriquecieron significativamente en procesos biológicos como la replicación del ADN, la regulación de la hematopoyesis, la regulación de la actividad hidrolasa y la producción de citoquinas; en los componentes celulares, que incluyeron vacuola lítica y lisosoma, se enriquecieron significativamente los genes que contienen colágeno y otros relacionados; en términos de función molecular, la actividad del receptor-ligando, la actividad de las citoquinas y otros genes relacionados se enriquecieron significativamente (Figura 5). En la Figura 5 se muestra el análisis de enriquecimiento de KEGG de las primeras 20 vías de señal significativamente alteradas por DEG.<0.05)were closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" differentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors="" [40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging="" [14].="" gene="" functional="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41.="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Verificación del Mecanismo de Acción de los CPs en el Alivio del Envejecimiento de la Piel

Para verificar el papel de la vía de señalización de TGF- y la interacción del receptor de citocinas en el alivio del envejecimiento de la piel por las PC orales, se realizó un análisis de WB para verificar el factor de transcripción Smad2/3 y el TGF- en la vía de señalización de TGF-, así como la clave factor de transcripción AP-1(c-Fos y c-Jun) que regula las citoquinas. Los contenidos de MMP-1, MMP-3, procolágeno tipo I e I-1 se determinaron mediante ELISA. Los resultados del análisis WB mostraron que la expresión de TGF-, Smad2 y Smad3 en el grupo M fue significativamente menor que en el grupo N (p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased="" significantly=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

La proteína AP-1 es un complejo dimérico de proteínas de la familia Jun y Fos y es un regulador importante de la inflamación de la piel y la expresión de citoquinas. Generalmente, el complejo compuesto por c-Jun y c-Fos muestra la mayor actividad transcripcional en la piel [41, A42]. Las ROS producidas en las células de la piel envejecidas primero activan la proteína AP-1 y luego regulan las citocinas posteriores (como IL-1 ), las MMP y la vía de señalización del TGF a través de la transcripción y la traducción, lo que facilita el envejecimiento de la piel [43 ,44]. La reacción de señalización de TGF-/Smad es una vía clásica de síntesis de colágeno, y el factor de transcripción Smad es el núcleo de esta vía de transducción de señales. El TGF- desencadena la fosforilación y activación de Smad2 y Smad3 aguas abajo al unirse al receptor, lo que aumenta la síntesis de COLI [14].

Además, los resultados de ELISA mostraron que el contenido de MMP-1, MMP-3 e IL-l en la piel del grupo M fue significativamente mayor que en el grupo N, y el contenido de Tipo I pro-colágeno fue significativamente menor (p<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,="" mmp-3,="" and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group="" (p=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mmps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1α="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Además de las vías anteriores, en este estudio, los genes regulados positivamente después del tratamiento con CP se enriquecieron significativamente en la vía del lisosoma, lo que indica que el tratamiento con CP activó el lisosoma en la piel (Figura 5). Estudios previos indican que los lisosomas activados eliminan los agregados y elevan la activación de las células madre neurales senescentes durante el envejecimiento [45]. Además de estos, el aumento de la función de los lisosomas puede reducir la concentración de ROS intracelular para prevenir la latencia celular. Del mismo modo, cualquier disminución en la función del lisosoma puede mejorar la concentración de ROS intracelular que, en última instancia, promueve la latencia celular [46]. Aunque no lo hemos verificado sistemáticamente en este artículo, estos resultados y los informes anteriores implican que la activación de la función lisosomal puede ser la principal forma en que los CP alivian el envejecimiento de la piel, y continuaremos tratando de verificarlo.

Por lo tanto, este estudio demostró que las PC dietéticas podrían aliviar el envejecimiento de la piel inducido por los rayos UV y la D-galactosa de manera dependiente de la dosis. Los CP alivian el envejecimiento de la piel al reducir los niveles de oxidación de la piel, inhibiendo la expresión de factores clave de transcripción AP-1(c-Jun y c-Fos), activando la vía de señalización TGF-/Smad para promover la síntesis de colágeno, inhibiendo la expresión de MMP-1 y MMP-3(que inhiben la degradación del colágeno) e inhibiendo la inflamación de la piel para aliviar el envejecimiento de la piel (Figura 8). Además, nuestros hallazgos en el actual

4. Conclusiones

En resumen, este estudio confirmó que la suplementación dietética de péptidos de colágeno de hueso de pollo podría aliviar significativamente el envejecimiento de la piel inducido por la radiación ultravioleta y la D-galactosa a través de múltiples vías, que incluyen promover la síntesis de pro-colágeno, inhibir la degradación del colágeno, mejorar el nivel de antioxidantes de la piel e inhibir inflamación; el alivio fue dependiente de la dosis con CP. Una investigación detallada mostró que los CP primero reducen el nivel de oxidación de la piel, inhiben la expresión del factor de transcripción clave AP-1(c-Jun y c-Fos), y luego activan la vía de señalización TGF-/Smad para promover la síntesis de colágeno, inhibir la expresión de MMP-1 y MMP-3 para inhibir la degradación del colágeno e inhibir la inflamación de la piel para aliviar el envejecimiento de la piel en ratones. Además, la activación de los lisosomas también puede ser la vía principal para que las PC alivie el envejecimiento de la piel, lo que merece una investigación y verificación de seguimiento. Estos resultados proporcionan una base teórica para implementar péptidos de colágeno para aliviar el envejecimiento de la piel y ampliar el alcance de la utilización integral de subproductos animales en alimentos funcionales.

Contribuciones de los autores: CCdiseñó, midió y escribió el manuscrito; ZXand HT diseñó y revisó el manuscrito; YL proporcionó orientación metodológica; CG y YW revisaron el manuscrito. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Este artículo está extraído de Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients