Parte 1 La doxorrubicina paradójicamente mejora la inflamación inducida por tumores en ratones jóvenes

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Ibrahim Y. Abdelgawad y otros

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Resumen:

doxorrubicina(DOX) es uno de los agentes quimioterapéuticos más utilizados en oncología pediátrica. DOX provoca una respuesta inflamatoria en múltiples órganos, lo que contribuye a los efectos adversos inducidos por DOX. El cáncer en sí mismo causa inflamación que conduce a múltiples condiciones patológicas. El estudio actual investigó la respuesta inflamatoria a DOX ytumoresutilizando un modelo de ratón EL4-linfoma, inmunocompetente, juvenil. A ratones C57BL/6N machos de cuatro semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea células de linfoma EL4 (5 × 104 células/ratón) en la región del flanco, mientras quetumorA los ratones libres se les inyectó vehículo. Tres días después de la implantación del tumor, se inyectó por vía intraperitoneal a los ratones sin tumor y con tumor DOX (4 mg/kg/semana) o solución salina durante 3 semanas. Una semana después de la última inyección de DOX, los ratones fueron sacrificados y los corazones, hígados,riñonesy se recogieron el suero. La expresión génica y la concentración sérica de marcadores inflamatorios se cuantificaron mediante PCR en tiempo real y ELISA, respectivamente. Tratamiento DOX significativamente suprimidotumorcrecimiento en ratones con tumores y causó una atrofia cardíaca significativa en ratones sin tumores y con tumores. Los tumores EL4 provocaron una fuerte respuesta inflamatoria en el corazón, el hígado yriñón. Sorprendentemente, el tratamiento con DOX mejoró la inflamación inducida por tumores, algo paradójico para el efecto de DOX en ratones sin tumores, lo que demuestra un efecto ampliamente divergente del tratamiento con DOX en ratones sin tumores versus ratones con tumores.

Palabras clave:doxorrubicina; tumor; inflamación

1. Introducción

La doxorrubicina (DOX), también conocida como adriamicina, es uno de los agentes quimioterapéuticos más utilizados en oncología clínica pediátrica. A pesar de su eficacia en una amplia gama de cánceres, incluidos el linfoma, la leucemia y otros cánceres pediátricos, la utilidad clínica de DOX es limitada debido a su toxicidad en múltiples órganos. Además de su marcada cardiotoxicidad [1], se ha demostrado que DOX causa nefrotoxicidad [2–5] y hepatotoxicidad [6]. Casi el 50 por ciento de los pacientes pediátricos con cáncer reciben DOX como parte de su protocolo de tratamiento [7]. Gracias a los tratamientos eficaces contra el cáncer, incluido el DOX, la tasa de supervivencia de 5-años de los niños diagnosticados con cáncer ha aumentado de menos del 60 % en la década de 1970 a más del 80 % en la actualidad [8,9]. Esto conduce a una gran población de sobrevivientes de cáncer infantil (CCS), que se estima en alrededor de 400,000. Desafortunadamente, los CCS tienen un alto riesgo de desarrollar efectos adversos a largo plazo debido al tratamiento del cáncer y/o al cáncer mismo.

Se ha demostrado que DOX desencadena inflamación sistémica [10–12] y una respuesta inflamatoria en múltiples órganos, incluido el corazón [13],riñón[14] e hígado [15]. Se ha demostrado que esta respuesta inflamatoria promueve los efectos adversos inducidos por DOX [16,17]. La mayoría de estos estudios que informan inflamación inducida por DOX se han realizado entumor-modelos animales libres que no imitan el escenario clínico en el que los pacientes pediátricos con cáncer reciben tratamiento DOX después del diagnóstico de cáncer. También se ha demostrado que el cáncer per se causa inflamación que contribuye a múltiples condiciones patológicas que pueden exacerbar las toxicidades inducidas por DOX [18,19]. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de establecer modelos animales clínicamente relevantes para investigar los mecanismos de toxicidad en múltiples órganos inducida por DOX en jóvenes,tumor-ratones portadores para estudiar la interacción entre el tratamiento DOX y el cáncer en sí mismo para causar tales toxicidades.

En el estudio actual, investigamos la respuesta inflamatoria a DOX y el tumor en un modelo de ratón juvenil inmunocompetente clínicamente relevante de linfoma EL4- singénico. Este modelo está bien establecido en la investigación del cáncer [20] y es clínicamente relevante para los pacientes pediátricos con cáncer, ya que el linfoma es uno de los tipos más comunes de cáncer pediátrico [21]. El uso de ratones singénicos es fundamental para estudiar la respuesta inflamatoria tanto a la DOX como al tumor debido al papel fundamental del sistema inmunitario en la patogenia de la inflamación [22]. La edad de los ratones era de 5 semanas después de la administración de DOX, lo que equivale a la edad de la adolescencia de 10 a 12 años en humanos [23]. Además, las dosis de DOX administradas son clínicamente relevantes para las dosis que reciben los pacientes pediátricos con cáncer [24]. Primero determinamos los efectos de DOX en la función cardíaca en ratones sin tumores y con tumores, ya que la cardiotoxicidad inducida por DOX se considera el efecto adverso clínicamente más relevante de DOX, entre otras toxicidades de múltiples órganos. Posteriormente, determinamos el efecto de DOX, el tumor y su combinación en varios marcadores inflamatorios en el corazón, el hígado yriñónademás de marcadores séricos de inflamación sistémica. Descubrimos que la presencia del tumor EL4 provocó una fuerte respuesta inflamatoria en múltiples órganos. Sorprendentemente, el tratamiento con DOX mejoró la inflamación inducida por el tumor, algo paradójico con respecto al efecto previamente informado de DOX en ratones sin tumor.

2. Resultados

2.1. Efectos de DOX sobre el peso corporal y el crecimiento tumoral

El estudio actual se estableció en ratones juveniles para imitar el escenario clínico en pacientes con cáncer pediátrico como se describe en la Figura 1A. No se observó una morbilidad o mortalidad significativa en ratones sin tumor o con tumor después de la exposición a DOX (4 mg/kg/semana durante 3 semanas), lo cual está de acuerdo con nuestro estudio anterior usando la misma dosis [25]. Sin embargo, la exposición juvenil a DOX resultó en un aumento de peso corporal significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con solución salina (Figura 1B). Para evaluar el efecto anticancerígeno de DOX en este modelo de linfoma EL4, medimos los pesos de los tumores después de la necropsia de los ratones. La administración crónica de DOX en ratones portadores de tumores inhibió significativamente el crecimiento del tumor EL4, lo que demuestra el efecto anticancerígeno de este régimen de dosificación de DOX (Figura 1C).

2.2. Efecto de la administración de DOX sobre la función cardíaca y la morfometría en ratones sin tumores y con tumores

DOX causó atrofia cardíaca como lo demuestra una disminución significativa en el peso del corazón a la longitud de la tibia (HW/TL) (Figura 1D). Sorprendentemente, la atrofia cardíaca causada por DOX aumentó en ratones con tumores (Figura 1D). Los efectos de DOX, el tumor y la combinación de ambos sobre la función y la morfología cardíaca se evaluaron mediante ecocardiografía transtorácica. Las imágenes representativas del modo M de cada grupo se muestran en la figura 2A. Ni DOX ni el tumor causaron cambios significativos en la fracción de eyección (Figura 2B), el gasto cardíaco (Figura 2C), el acortamiento fraccional (Figura 2D), la masa del ventrículo izquierdo (LV) (Figura 2E), el grosor de la pared posterior del LV en diástole (LVPW' d) (Figura 2F), o espesor de la pared posterior del VI en sístole (LVPW's) (Figura 2G).

2.3. Efecto de la administración de DOX en la expresión génica de marcadores inflamatorios en el corazón de ratones con tumores y sin tumores

Se recolectaron corazones de ratones C57BL/6N juveniles sin tumor y con tumor de linfoma EL4 una semana después de la administración de 4 mg/kg/semana de DOX o un volumen equivalente de solución salina estéril durante 3 semanas (n=8 por grupo). Después de la extracción del ARN total, la expresión del ARNm cardíaco de los marcadores inflamatorios interleucina-1 alfa (IL-1 ), interleucina-1 beta (IL-1 ), interleucina{{12} } (IL-6), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-), proteína quimioatrayente de monocitos de quimiocinas inflamatorias-1 (Mcp-1) y quimiocinas de motivo CX C (Cxcl1, Cxcl9 y Cxcl10) se determinaron mediante PCR en tiempo real. La expresión génica de múltiples marcadores inflamatorios en el corazón aumentó significativamente en ratones con tumores en comparación con ratones sin tumores, incluidas las citoquinas proinflamatorias IL-1 (Figura 3A), IL-1 ( Figura 3B), IL-6 (Figura 3C) y TNF- (Figura 3D) y las quimiocinas inflamatorias Mcp-1 (Figura 3E), Cxcl1 (Figura 3F) y Cxcl10 (Figura 3H). Si bien la administración de DOX en ratones sin tumor no produjo cambios significativos en la expresión de marcadores inflamatorios en el corazón, la administración de DOX anuló significativamente la regulación positiva de IL inducida por el tumor-1 (Figura 3B), Mcp{{44} } (Figura 3E), Cxcl9 (Figura 3G) y Cxcl10 (Figura 3H). Es importante destacar que ANOVA bidireccional demostró un efecto de interacción significativo en todos los marcadores excepto Cxcl1, Cxcl9 y Cxcl10, lo que demuestra los efectos divergentes que tiene DOX en los marcadores inflamatorios cardíacos en ratones con tumores en comparación con ratones sin tumores.

2.4. Efecto de la administración de DOX en la expresión génica de marcadores inflamatorios en el hígado de ratones sin tumor y con tumor

Se recogieron hígados de ratones C57BL/6N juveniles con tumor de linfoma EL4 y sin tumor una semana después de la administración de 4 mg/kg/semana de DOX o un volumen equivalente de solución salina estéril durante 3 semanas (n=8 por grupo). Después de la extracción del ARN total, la expresión del ARNm hepático de los marcadores inflamatorios IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 y Cxcl10 fueron determinados por PCR en tiempo real. Los ratones portadores de tumores tenían una expresión hepática significativamente elevada de las citoquinas proinflamatorias IL-1 (Figura 4A), IL-1 (Figura 4B), TNF- (Figura 4D), Cxcl9 (Figura 4G), y Cxcl10 (Figura 4H) en comparación con ratones sin tumor. Aunque menos notable, ANOVA bidireccional demuestra un efecto significativo del tumor en la expresión del gen hepático de IL-6 (Figura 4C). ANOVA bidireccional demostró un efecto de interacción significativo entre el tumor y DOX en Cxcl10 (Figura 4H). La administración de DOX redujo la regulación positiva inducida por el tumor de IL-1 y TNF- (Figura 4B, D). Ni DOX ni el tumor tuvieron un efecto significativo sobre la expresión hepática de las quimiocinas inflamatorias Mcp-1 y Cxcl1 (Figura 4E, F).

2.5. Efecto de la administración de DOX en la expresión génica de marcadores inflamatorios en el riñón de ratones sin tumor y con tumor

Se recolectaron riñones de ratones C57BL/6N juveniles con tumor de linfoma EL4 y sin tumor una semana después de la administración de 4 mg/kg/semana de DOX o un volumen equivalente de solución salina estéril durante 3 semanas (n=8 por grupo). Después de la extracción del ARN total, la expresión del ARNm renal de los marcadores inflamatorios IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 y Cxcl10 fueron determinados por PCR en tiempo real. De acuerdo con los cambios observados en el corazón y el hígado, los ratones portadores de tumores habían aumentado significativamente la expresión renal de las citoquinas proinflamatorias IL-1 (Figura 5A), IL-1 (Figura 5B), TNF- (Figura 5D) y Mcp-1 (Figura 5E) en comparación con ratones sin tumor. Además, ANOVA de dos vías demuestra un efecto significativo del tumor en la expresión génica renal de Cxcl1 (Figura 5F), Cxcl9 (Figura 5G) y Cxcl10 (Figura 5H). La administración de DOX en ratones con tumores mejoró significativamente la regulación positiva inducida por el tumor de IL-1 (Figura 5B), IL-6 (Figura 5C), TNF- (Figura 5D) y Mcp{{43} } (Figura 5E). Dentro de esos marcadores, ANOVA de dos vías también demostró una interacción significativa entre DOX y el tumor, demostrando los diferentes efectos que tiene DOX en los marcadores inflamatorios renales en ratones con tumor en comparación con ratones sin tumor.

2.6. Efecto de la administración de DOX en las características histopatológicas del corazón, el hígado y el riñón de ratones sin tumor y con tumor

Se recolectaron corazones, hígados y riñones de una cohorte de ratones C57BL/6N juveniles sin tumor y con tumor de linfoma EL4 una semana después de la administración de 4 mg/kg/semana de DOX o un volumen equivalente de solución salina estéril durante 3 semanas ( n=4 por grupo). La evaluación histopatológica no demostró cambios patológicos importantes en el corazón (Figura 6A). Solo se observó una mínima infiltración de células inflamatorias, demostrada como focos raros de inflamación mínimamente celular mixta (mononuclear y neutrofílica), en los tejidos hepáticos recolectados de tumores libres de tumores tratados con DOX (tres de cuatro ratones), tratados con solución salina ( dos de cuatro ratones) y ratones portadores de tumores tratados con DOX (tres de cuatro ratones) (Figura 6B). La evaluación histopatológica de los riñones no demostró cambios patológicos importantes en todos los grupos, excepto en los ratones portadores de tumores tratados con DOX (Figura 6C), y dos de los cuatro ratones de este grupo demostraron regiones de regeneración tubular de espesor total, fibrosis y lesiones intersticiales leves. inflamación que afecta aproximadamente al 5 por ciento del área total del tejido.

2.7. Efectos divergentes de DOX sobre las citoquinas inflamatorias séricas en ratones libres de tumores y ratones con tumores

Anteriormente informamos que la administración aguda de DOX provocó una respuesta inflamatoria sistémica en ratones adultos C57BL/6N [11]. En este documento, determinamos el efecto de la administración crónica de DOX en los niveles séricos de los marcadores inflamatorios IL-6 y TNF-, en ratones juveniles sin tumores y con tumores. Los ratones portadores de tumores tratados con solución salina demostraron un aumento marcado, aunque estadísticamente insignificante, en la IL-6 sérica (Figura 7A) y TNF- (Figura 7B) en comparación con los ratones sin tumores. Es importante destacar que ANOVA de dos vías demostró una interacción significativa entre la administración de DOX y el tumor en los niveles séricos de IL-6 y TNF-. De hecho, la administración de DOX normalizó la regulación positiva inducida por el tumor de IL-6 a un nivel similar al de los ratones sin tumor de control (Figura 7A).