Parte 1|La variación genética implica la angiopoyetina plasmática-2 en el desarrollo de subfenotipos de lesión renal aguda

Pavan K. Bhatraju1,2*, Max Cohen1, Ryan J. Nagao3,4, Eric D. Morrell1, Susanna Kosamo1, Xin-Ya Chai1, Robin Nance5, Victoria Dmyterko1, Joseph Delaney5, Jason D. Christie6, Kathleen D. Liu7, Carmen Mikacenic1, Sina A. Gharib1, W. Conrad Liles8, Ying Zheng3,4, David C. Christiani9,10, Jonathan Himmelfarb2 y Mark M. Wurfel1,2

Resumen

Fondo:Previamente identificamos dosagudoriñónlesión(AKI) subfenotipos (AKI-SP1 y AKI-SP2) con diferentes riesgos de malos resultados clínicos y respuestas a la terapia vasopresora. Los biomarcadores plasmáticos de disfunción endotelial (receptor del factor de necrosis tumoral-1, angiopoyetina-1 y 2) diferenciaron los subfenotipos de LRA.

Sin embargo, se desconoce si estos biomarcadores son simplemente marcadores o mediadores causales en el desarrollo de subfenotipos de LRA.

Métodos:Probamos las asociaciones entre los polimorfismos de un solo nucleótido dentro delangiopoyetina-1, angiopoyetina-2,yReceptor 1A del factor de necrosis tumoralgenes y AKI-SP2 en 421 sujetos críticamente enfermos de ascendencia europea. Se probaron los polimorfismos de un solo nucleótido de alto rendimiento (FDR < 0.05)="" para="" la="" expresión="" de="" biomarcadores="" cis="" y="" si="" el="" riesgo="" genético="" de="" aki-sp2="" está="" mediado="" por="" biomarcadores="" circulantes.="" también="" completamos="" estudios="" in="" vitro="" utilizando="" células="" endoteliales="" microvasculares="" de="" riñón="" humano.="" finalmente,="" calculamos="" el="" aclaramiento="" renal="" de="" biomarcadores="" plasmáticos="" utilizando="" 20="" recolecciones="" de="" orina="" cronometradas="">

Resultados:Una variante genética, rs2920656C > T, cercaANGPT2se asoció con un riesgo reducido de AKI-SP2 (odds ratio, 0.45; IC del 95 por ciento, 0.31–0.66; FDR ajustado=0.003 ) y disminución de la angiopoyetina plasmática-2 (p = 0.002). El análisis de inferencia causal mostró que para cada alelo menor (T) el riesgo de desarrollar AKI-SP2 disminuye en un 16 por ciento. La angiopoyetina plasmática -2 mediaba el 41,5 por ciento del riesgo relacionado con rs2920656 de AKI-SP2. Las células endoteliales microvasculares de riñón humano que portaban el alelo T de rs2920656 produjeron niveles numéricamente más bajos de angiopoyetina-2 aunque esto no fue estadísticamente significativo (p = 0.07). Finalmente, los análisis demostraron que la angiopoyetina-2 se elimina mínimamente en sujetos gravemente enfermos.

Conclusión:El análisis de mediación genética proporciona evidencia de apoyo de que la angiopoyetina-2 juega un papel causal en el riesgo de AKI-SP2.

Palabras clave: Lesión renal aguda, Genética, Endotelio

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Fondo

Agudoriñónlesión(AKI) afecta al 40-60 por ciento de los pacientes ingresados ​​en la unidad de cuidados intensivos (UCI) y contribuye a los malos resultados a corto y largo plazo. Los estudios genéticos hasta la fecha se han centrado en las asociaciones entre las variantes genéticas y el riesgo de AKI comparando casos (AKI) con controles (sin AKI). Sin embargo, este marco puede verse limitado porque los casos deAgudoriñónlesiónson altamente heterogéneos con diferentes precipitantes y perfiles biológicos. La combinación de tales pacientes con LRA para maximizar el tamaño de la muestra puede resultar en la dilución de las señales estadísticas genéticas que podrían estar presentes solo en un subconjunto fisiopatológicamente distinto de la población con LRA. Otra limitación es que la AKI en poblaciones en estado crítico a menudo es una complicación de lesiones graves, como sepsis, cirugía, shock, neumonía y trauma. El uso de controles sin el desarrollo deAgudoriñónlesiónpuede ser problemático. Es posible que los controles que portan una variante genética de alto riesgo no desarrollen LRA si no experimentan una lesión aguda similar a la de los casos y, por lo tanto, se clasificarían como no casos, lo que atenuaría cualquier posible señal de asociación. El uso de subfenotipos de AKI biológicamente distintos en los estudios de asociación genética supera las limitaciones previas en el fenotipo de AKI al centrarse específicamente en la población de AKI y al comparar dos subfenotipos biológicamente distintos.

Recientemente identificamos dos subfenotipos de AKI (AKI-SP1 y AKI-SP2) mediante la aplicación de la metodología de análisis de clases latentes a un panel de 29 variables clínicas y de biomarcadores en dos poblaciones independientes de AKI en estado crítico. En particular, AKI-SP2 se asoció con peores resultados hospitalarios (p. ej., mortalidad, nueva diálisis y falta de recuperación renal de 7-días) en comparación con AKI-SP1. A continuación, identificamos estos subfenotipos de AKI en un ensayo de control aleatorio multicéntrico previamente completado, Vasopresina versus infusión de norepinefrina en pacientes con shock séptico (VASST). El ensayo VASST estudió si la elección de la terapia vasopresora mejoraba la mortalidad en sujetos con shock séptico. Si bien la población con LRA en el ensayo clínico no tuvo diferencia en la mortalidad por la terapia con vasopresores, AKI-SP1 tuvo un beneficio de mortalidad con vasopresina en comparación con AKI-SP2 sin diferencia de mortalidad. Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de identificación de subgrupos de LRA que responden al tratamiento en pacientes en estado crítico.

En particular, ninguna variable individual fue estadísticamente mejor que las otras variables para identificar AKI-SP2 (Tabla 1). Por el contrario, un modelo de tres variables que usa angiopoyetina plasmática-2 (ANG-2), angiopoyetina-1 (ANG-1) y receptor del factor de necrosis tumoral soluble{{8 }} (sTNFR-1), tuvo el rendimiento predictivo óptimo para diferenciarAgudoriñónlesiónsubfenotipos (estadística C 0.93). Un ANG más bajo-2, un sTNFR más bajo-1 y un ANG más alto-1 se asociaron con un riesgo más bajo de LRA-SP2. Los estudios en modelos animales de AKI han demostrado que estos biomarcadores plasmáticos están involucrados en la

Fisiopatología y severidad de la LRA. Sin embargo, se desconoce si estos biomarcadores plasmáticos juegan un papel causal en el desarrollo de síntomas clínicos.Agudoriñónlesiónsubfenotipos. La identificación de marcadores causales podría informar objetivos para el desarrollo de fármacos para prevenir o tratar el desarrollo deAgudoriñónlesiónen los enfermos críticos y podría ayudar en la estratificación del riesgo del paciente.

El análisis de mediación genética es uno de varios enfoques de inferencia causal que pueden identificar el mecanismo potencial por el cual una variable independiente (p. ej., variante genética) afecta el resultado (p. ej., subfenotipos de AKI) a través de un mediador explicativo (p. ej., biomarcador de disfunción endotelial) . Este enfoque se ha aplicado ampliamente en datos clínicos para comprender los mecanismos causales de la enfermedad. Presumimos que los loci de rasgos cuantitativos cis (QTL) en elANGPT1, ANGPT2 y TNFRSF1Alos genes influyen en el desarrollo de los subfenotipos de AKI al regular los niveles circulantes de sus respectivos biomarcadores (ANG-1, ANG-2 o sTNFR-1).

Métodos

Poblaciones de estudio

Anteriormente informamos sobre la identificación de subfenotipos de LRA utilizando una cohorte de UCI recolectada prospectivamente: identificación de polimorfismos de nucleótido único (SNP) que predisponen al riesgo alterado de lesión pulmonar aguda (iSPAAR). La población iSPAAR es un estudio de casos y controles de todo el genoma del riesgo de síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) que incluyó pacientes con y sin SDRA. La población de iSPAAR incluyó sujetos de ensayos controlados aleatorios previamente completados y de una cohorte de UCI inscrita prospectivamente. Los detalles del diseño del estudio para cada población inscrita en iSPAAR se han descrito previamente; Albuterol para el tratamiento de la lesión pulmonar aguda (ALTA), Prueba de tratamiento con fluidos y catéteres (FACTT), Ácido graso enteral omega-3, ácido gamma-linolénico y suplementos antioxidantes en la lesión pulmonar aguda (OMEGA)

y Epidemiología Molecular de la Dificultad Respiratoria Aguda (MEA) en el Hospital General de Massachusetts. Dentro de iSPAAR, la inscripción en el estudio se produjo 48 h después del ingreso en la UCI. En el momento de la inscripción en el estudio, se recolectó ADN y plasma para el análisis de genotipos y biomarcadores, seguido deAgudoriñónlesióncomprobación. La LRA se definió como un aumento en la creatinina sérica (SCr) mayor o igual a 0.3 mg/dl o 50 por ciento de la SCr "inicial". La SCr inicial se definió como el valor más bajo antes de la inscripción en el estudio. La LRA también se definió utilizando criterios modificados de producción de orina (producción diaria en lugar de cada 6 h).

Para determinar la eliminación renal de los biomarcadores plasmáticos, inscribimos una cohorte prospectiva en las unidades de cuidados intensivos médicos y quirúrgicos de Harborview, el Centro de Enfermedades CríticasAgudoriñónlesiónCohorte (CIA). Los sujetos eran elegibles para la inscripción si cumplían con 2 de los 4 criterios del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tenían sospecha clínica de infección y tenían colocado un catéter urinario permanente. Se completó una recolección de orina cronometrada que duró al menos 2-4 h y se recolectaron muestras de plasma con EDTA al principio y al final de la recolección de orina cronometrada. El espacio libre se calculó utilizando la fórmula Espacio libre(X) = U(X) * V/ P(X), dóndeU(X) representa la concentración de soluto en la orinaX, V indica el volumen de orina durante el período de recolección de 2–4-h, yP (X) representa las concentraciones plasmáticas promedio de solutoX de las extracciones de sangre inicial y final.

estrategia de genotipado

El genotipado se realizó en 421 pacientes de ascendencia europea utilizando la plataforma Illumina 660 (Illumina, San Diego, CA). La calidad de los datos genotipados se controló mediante un filtro de tasa de llamada de muestra > 0.97, frecuencia de alelo menor (MAF) > 0.01 y tasa de llamada SNP > 0.95. Después del control de calidad, 238 SNPs ±50 kilobases deANGPT1, ANGPT2,yTNFRSF1Afueron encontrados. Después de la poda del desequilibrio de ligamiento (LD) de un r²de {{0}}.8, se eliminaron 48 SNP, lo que dio lugar a un total de 190 SNP utilizados en las pruebas de asociación. La imputación se realizó utilizando el panel de referencia del Proyecto 1000 Genomas usando IMPUTE2 v2.3.0.

Evaluación de proteínas plasmáticas

Los biomarcadores urinarios y plasmáticos se midieron mediante inmunoensayos electroquimioluminiscentes (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD), como se describió anteriormente. La sangre se recogió en tubos estériles tratados con EDTA, la orina se recogió en recipientes estériles y ambos se centrifugaron inmediatamente. A continuación, el plasma y la orina se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 grados. Las muestras se almacenaron durante diferentes duraciones, pero se descongelaron en un solo lote y solo una vez para realizar las mediciones de biomarcadores para este estudio. Todas las mediciones de biomarcadores se realizaron por duplicado en Harborview Pulmonary Research Laboratories.

Análisis In Silico

Para probar los SNP para la expresión de los efectos de QTL, consultamos el portal Genotype-Tissue Expression (GTEx).

Cultivo de células

Se purificaron células endoteliales microvasculares de riñón humano (HKME Cs) de riñones fetales después de interrupciones voluntarias del embarazo entre 100 y 135 días después de la concepción. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para el uso de tejidos fetales. Luego elegimos aleatoriamente 9 HKMEC de donantes diferentes, descongelamos y sembramos en placas medio millón de células en frascos T25 recubiertos con gelatina al 0,2 % y mantenidos en medio basal EBM-2 que contenía 1 % de antibiótico-antimicótico (Life Technologies), 10 % de FBS, 100 ug/mL de ECGS, 50 ug/mL de heparina y 20 ng/mL de VEGF (R&D), durante 48 h hasta la confluencia. A las 48 h, purificamos el ADN genómico de las HKMEC y se recogieron los sobrenadantes celulares. Genotipamos con éxito células de 8 donantes.

análisis estadístico

Las variables demográficas de los pacientes se informan como media más desviación estándar o como mediana y cuartiles. Primero, usamos la regresión logística para probar una asociación entre los 190 SNP y el desarrollo de AKI-SP2 en comparación con AKI-SP1 usando un modelo genético aditivo (Golden Helix, MT). Nuestro modelo se utilizó para las siguientes covariables: edad, sexo, sepsis y los primeros cinco componentes principales. Se utilizó el método Eigenstrat v4.2 para calcular los componentes principales y los cinco principales se incluyeron como covariables. Los cocientes de probabilidades (OR) se informan con intervalos de confianza del 95 por ciento. Para el análisis entre las variantes genéticas y los subfenotipos de AKI, corregimos las comparaciones múltiples mediante el uso de un umbral de tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg < 0,10,="" que="" estima="" que="" menos="" del="" 10="" %="" de="" las="" asociaciones="" con="" un="" valor="" de="" fdr="" igual="" o="" inferior="" a="" este="" nivel="" son="" falsos="" positivos="" [31].="" en="" un="" análisis="" de="" sensibilidad,="" se="" utilizó="" un="" genotipo="" imputado="" para="" identificar="" snp="" adicionales="" asociados="" con="">

En segundo lugar, utilizamos el ajuste de regresión lineal por edad, sexo y sepsis para determinar las asociaciones entre los SNP de mayor rendimiento y el registro₂concentraciones de biomarcadores transformados. En tercer lugar, completamos un análisis de inferencia causal para probar la asociación entre las variantes genéticas y AKI-SP2 y la mediación potencial de la asociación por las concentraciones de biomarcadores en plasma. El análisis de mediación se realizó utilizando la implementación no lineal del modelo de ecuaciones estructurales implementado en el paquete de mediación para STATA [32, 33]. En el suplemento en línea se proporcionan detalles adicionales del análisis de inferencia causal. En cuarto lugar, determinamos las asociaciones entre las variantes genéticas y la gravedad de la LRA, medida por la creatinina sérica máxima, mediante regresión logística. Se proporcionan detalles adicionales de materiales y métodos en el suplemento en línea. En el análisis, evaluamos 190 SNP y usamos un método conservadorvalor pde 0.05/190 =2.6 × 10^{− 4}. Dado que aproximadamente el 40 por ciento de los pacientes de la UCI desarrollan LRA y una proporción esperada de control (LRA-SP1) a caso (LRA-SP2) de 1,5, un tamaño de muestra esperado de 421 y un MAF de al menos { {16}}.30, tendremos una potencia del 81 por ciento para detectar un riesgo relativo de 1,5 o mayor [34]. Los análisis se completaron utilizando STATA (Versión 15) y Goldenhelix (Versión 4.0). Todos los estudios fueron aprobados por la División de Sujetos Humanos de la Universidad de Washington. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos inscritos.

Resultados

Características de las poblaciones De los 425 pacientes de la cohorte de validación en nuestro trabajo anterior, 421 tenían datos de genotipado disponibles. Las características demográficas y clínicas iniciales se describen en la Tabla 1. Todos los sujetos eran de ascendencia europea. Un total de 267 (63 por ciento) se clasificaron como AKI-SP1 y 154 (37 por ciento) como AKI-SP2. Los sujetos que desarrollaron AKI-SP2 tenían una mayor gravedad de la enfermedad en la presentación (puntuaciones medias de fisiología aguda y evaluación de la salud crónica (APACHE) III, 111 ± 26 frente a 74 ± 24), tenían más probabilidades de tener sepsis (84 % frente a 66 %) y tenían más probabilidades de ser tratados con vasopresores (79 por ciento frente a 42 por ciento) en comparación con AKI-SP1.

La variación genética cerca de ANGPT2, rs2920656, está asociada con AKI-SP2

De los 190 SNP ±50 kilobases de los genes, 72 estaban cerca de ANGPT1, 100 estaban cerca de ANGPT2 y 18 estaban cerca del gen TNFRSF1A. Identificamos un SNP que cumplió con un FDR < 0.05="" que="" se="" asoció="" con="" aki-sp2="" en="" comparación="" con="" aki-sp1="" (tabla="" 2="" y="" fig.="" 1).="" no="" se="" observaron="" asociaciones="" significativas="" con="" snp="" en="" o="" cerca="" de="" angpt1="" o="" tnfrsf1a="" (tabla="" s2="" y="" s3).="" el="" snp="" que="" demostró="" la="" asociación="" más="" sólida="" con="" el="" riesgo="" de="" aki-sp2="" fue="" rs2920656="" (or,="" 0,45;="" ic="" del="" 95="" %,="" 0,31–0,66;="" p="">< 1,4="" ×="" 10−="" 5="" ;="" fdr="0,003)." este="" snp="" intrónico="" es="" ≈="" 30="" kb="" aguas="" abajo="" de="" la="" posición="" 3="" 'de="" angp="" t2="" y="" explica="" aproximadamente="" el="" 3="" por="" ciento="" de="" la="" variación="">

el desarrollo de AKI-SP2 (R2). Debido a que solo una pequeña cantidad de sujetos eran homocigotos rs2920656 (n=26), también probamos las asociaciones entre rs2920656 y AKI-SP2 en un modelo genético dominante, lo que dio resultados consistentes. resultados (OR, 0,42; IC del 95 %, 0,28–0,64; p < 1,4="" ×="" 10−="" 6="" ).="" también="" probamos="" asociaciones="" adicionales,="" potencialmente="" más="" fuertes,="" dentro="" del="" locus="" angpt2="" usando="" genotipos="" imputados,="" pero="" no="" encontramos="" ninguna="" asociación="" más="" fuerte="" que="" la="" observada="" con="" rs2920656="" (tabla="" s4).="" en="" un="" análisis="" de="" sensibilidad,="" probamos="" si="" la="" inclusión="" de="" pacientes="" en="" estado="" crítico="">Agudoriñónlesióninfluiría en la asociación genética. Agrupamos a los pacientes sin AKI y AKI-SP1 juntos y determinamos si rs2920656 todavía estaba fuertemente asociado con una disminución del riesgo de AKI-SP2. En este análisis, 839 pacientes no tenían AKI o AKI-SP1 y 154 tenían AKI-SP2. El riesgo de desarrollar AKI-SP2 nuevamente se redujo significativamente al tener al menos un alelo T para rs2920656 (OR 0.31; IC del 95 por ciento, 0.19–0.52; p < 0,001)="" (tabla="" s5).="" en="" otro="" análisis="" de="" sensibilidad,="" probamos="" si="" rs2920656="" se="" asoció="" con="" un="" menor="" riesgo="" de="" aki-sp2="" dentro="" de="" cada="" uno="" de="" los="" cuatro="" estudios="" diferentes="" que="" se="" incluyeron="" en="" ispaar.="" dentro="" de="" cada="" uno="" de="" los="" tres="" ensayos="" controlados="" aleatorios="" (alta,="" factt="" y="" omega)="" y="" la="" cohorte="" prospectiva="" de="" uci="" (mea),="" la="" estimación="" puntual="" fue="" consistente="" con="" el="" alelo="" menor="" de="" rs2920656,="" lo="" que="" demuestra="" una="" disminución="" del="" riesgo="" de="" desarrollar="" aki-sp2="" (tabla="" s6="" ).="" por="" lo="" tanto,="" rs2920656="" se="" analizó="" más="" para="" determinar="" la="" asociación="" con="" las="" concentraciones="" de="" biomarcadores="" en="">

El alelo T de rs2920656 está asociado con una disminución de la ANG plasmática-2

A continuación, analizamos la asociación entre rs2920656 y las concentraciones plasmáticas de ANG-2. Al ajustar por edad, género y sepsis, cada copia del alelo T de rs2920656 se asoció con una disminución de las concentraciones de ANG en plasma log2-2 (= − 0,09; IC del 95 por ciento {{9} }.15, − 0.04;P=0.002). Los sujetos homocigotos para el alelo C mostraron las concentraciones plasmáticas más altas de ANG-2 (40 683 pg/ml; rango intercuartílico (RIC) 19,374-73,205), mientras que los sujetos homocigotos para el alelo T mostraron las concentraciones más bajas concentraciones plasmáticas de ANG-2 (28 308 pg/ml (IQR 14,340-42, 944). Además, de los 100 SNP probados cerca de la región del gen ANGP T2, rs29206565 fue el más asociado con la ANG plasmática -2 concentraciones (Fig. 2).

El análisis de mediación sugiere que ANG-2 es causal en el desarrollo de AKI-SP2

Probamos la evidencia de que la asociación entre rs2920656 y el riesgo de AKI-SP2 está mediada por las concentraciones plasmáticas de ANG-2 (Fig. 3). El efecto total de rs2920656 en AKI-SP2 fue total=− 0.16 por alelo (95 por ciento IC -0.24, − 0 .10, p=1.0 × 10− 4 ), lo que sugiere que para cada alelo menor (alelo T) de la variante genética, el riesgo de desarrollar AKI-SP2 disminuye en un 16 por ciento . El análisis de mediación causal detectó un efecto indirecto significativo para rs2920656 en AKI-SP2 que fue mediado a través de las concentraciones plasmáticas de ANG-2 ( indirecta, − 0,07 por alelo; IC del 95 % -0,11, − 0,03; p { {34}}.001), lo que significa que la proporción de efecto entre rs2920656 y AKI-SP2 mediada por concentraciones de ANG-2 es del 41,5 por ciento.

El alelo T de rs2920656 se asocia con una disminución de la gravedad de la LRA a los 7 días

A continuación, probamos la asociación de rs2920656 con los criterios tradicionales de gravedad de la LRA, como la creatinina sérica máxima y el aumento de la creatinina sérica dentro de los 7 días posteriores a la inscripción en el estudio. En un modelo genético dominante, el alelo T de rs2920656 se asoció con una disminución de la creatinina sérica de − 0,44 mg/dL (IC del 95 %, − 0,77 , − 0.10), p=0.01) después de ajustar por edad, género, índice de masa corporal y estado de sepsis. El alelo menor de rs2920656 también se asoció con una disminución en el aumento de la creatinina sérica entre el inicio y el día 7 (= − 0,25, IC del 95 %, − 0,46, − 0,03; p=0,03)

El alelo T de rs2920656 está asociado con una ANG más baja-2 en cultivo celular

Realizamos experimentos in vitro y análisis in silico para determinar la importancia funcional de rs2920656. De 8 fetos humanos diferentesriñóntejidomuestras, 2 eran CC, 5 eran CT y 1 era TT para rs2920656. En un modelo genético dominante, las concentraciones de ANG-2 fueron numéricamente mayores en células endoteliales de donantes homocigóticos para el alelo C y menores en portadores del alelo T, p=0.07 (Fig. 4). En la base de datos del proyecto GTEx, rs2920656 no se asoció con la expresión del gen ANGPT2. Sin embargo, otros dos SNP (rs41311412 y rs2515591) que se encuentran en LD moderada (r2=0.23 y D'=0.86) con rs2920656 se asociaron con una expresión reducida del gen ANGPT2 (p=4.1 × 10− 5 ) en la arteria tibial, un tejido altamente enriquecido en células endoteliales (Tabla S7).

El ANG plasmático-2 es eliminado mínimamente por los riñones Para determinar si las diferencias enriñónfunciónpodría influir en las concentraciones plasmáticas de ANG{{0}}, medimos el aclaramiento renal de ANG-2 en sujetos gravemente enfermos con y sin LRA. En 20 recolecciones de muestras de orina cronometradas diferentes con muestras de plasma sujetas a libros, la mediana de la creatinina sérica fue de 0,86 mg/dL con un rango intercuartílico (RIC) de 0,69 a 1,45 mg/dL. La mediana de la concentración plasmática de ANG-2 fue de 10 261 pg/mL (IQR 6210–19 115 pg/mL). Por el contrario, las concentraciones urinarias de ANG-2 fueron 50-veces más bajas con una mediana de 206 pg/ml (IQR 11–839 pg/ml). El aclaramiento renal calculado de ANG-2 fue < 1="" ml/min="" para="" todas="" las="" recolecciones="" de="" orina="" cronometradas,="" lo="" que="" sugiere="" que="" las="" concentraciones="" plasmáticas="" de="" ang-2="" no="" aumentan="" simplemente="" en="" función="" del="" empeoramiento="" de="" la="" lra="" (tabla="">