Parte 2: La calpastatina previene la lesión de podocitos mediada por angiotensina a través del mantenimiento de la autofagia

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Angel + HSD activa la actividad de la calpaína en los podocitos que contribuye al bloqueo de la autofagia

Como se encontró que la actividad de la calpaína (i) era activada por Angel en varios tipos de células y (ii) para escindir varias proteínas relacionadas con la autofagia, nos preguntamos si el bloqueo de autofagia mediado por AngII + HSD podría ser atribuible al aumento de la actividad de la calpaína inducida por Angl. Primero encontramos que los podocitos primarios expresaban las 3 formas ubicuas de calpaínas (Figura 3a). Luego demostramos que AngII estimuló la actividad de la calpaína en los podocitos primarios. Este aumento en la actividad de la calpaína fue bloqueado por un inhibidor selectivo de la calpaína (Figura 3b). Se utilizó un ratón knock-in con expresión adicional de transgenes de calpastatina (lo que llevó a una disminución de la actividad de calpaína) para evaluar el papel de las calpaínas en AngII + mediado por HSDriñónHeriday bloqueo de autofagia. Los podocitos primarios de ratones CST'g mostraron una disminución de la actividad de calpain en respuesta a AngII en comparación con los podocitos de ratones control (Figura 3c). Por lo tanto, la sobreexpresión de calpastatina en los podocitos disminuyó la activación de la calpaína mediada por AngII.

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A continuación, evaluamos los niveles de autofagia en podocitos de ratones CSTTg. Generamos ratones CST con el transgén GFP-LC3. El reportero LC3-GFP permitió el conteo de autofagosomas como puntos GFP+/P62+. P62 se acumulará en agregados en las células cuando se bloquee el flujo autofágico. En el estado basal, contamos menos puntos GFP+ P62+ (Figura 4a, b y e) y menos acumulación de P62 (Figura 4c, d y f) en podocitos de ratones CST1g GFP-LC3 que en podocitos de normal

Figura 4| Evaluación del flujo autofágico en podocitos de ratones transgénicos de calpastatina (CST9). a,b) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) (verde) y P62 (rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 y CST'GFP-LC3 de 12 semanas de edad. Las puntas de flecha indican autofagosomas GFP+ P62+. (c,d) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de P62 (verde) y podocalidina (PODXL; rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 y CST'9 GFP-LC3 de 12 semanas de edad. Las subpartes de la figura con primo indican un aumento más alto. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barras = 50 μm. e) Cuantificación del número de puntos LC3+ P62+ por podocito. Prueba de Mann-Whitney:**P=0.0065. f) Cuantificación del área P62+ por sección glomerular. Prueba de Mann-Whitney:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 ratones GFP-LC3 y n =8 ratones CST'9 GFP-LC3. Los valores se presentan como gráficas individuales y media± SEM. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en ratones GFP-LC3, que sugiere un aumento del flujo autofágico en podocitos de ratones con alta abundancia de calpastatina.

El flujo autofágico puede ser monitoreado por la medición de la conversión de la forma citoplasmática de LC3, LC3-I, a la forma autofagosómica escindida y fosfatidiletanolamina acoplada de LC3, LC3-II, en el Western blot. Los podocitos de ratones CST mostraron un aumento de la conversión de LC3-I a LC3-II y una disminución de la expresión de P62, tanto en presencia como en ausencia de bafilomicina A, (Figura 5a y b), lo que indica un aumento del flujo autofágico en podocitos con sobreexpresión de calpastatina. Finalmente, la acumulación de puntos GFP+P62+ en podocitos después de la administración de cloroquina fue más importante en ratones CST'g GFP-LC3 que en ratones GFP-LC3, confirmando así que la sobreexpresión de calpastatina induce flujo autofágico en podocitos in vivo (Figura 5c-e). En conjunto, nuestros datos sugieren que AngII estimula la actividad de la calpatina en los podocitos, que la autofagia es inhibida por la calpaína en los podocitos, y que la inhibición de la actividad endógena de la calpaceína por la sobreexpresión de calpastatina es suficiente para estimular el flujo autofágico en los podocitos.

Los ratones CSTT9 están protegidos de la lesión de podocitos inducida por Angel + HSD

CSTT: los ratones no mostraron ningunariñónalteración hasta al menos los 12 meses de edad (Figura suplementaria S5). Analizamos la lesión de podocitos en ratones CST'号 durante el tratamiento con AngII + HSD. Aunque los ratones WT desarrollaron glomeruloesclerosis leve y lesión de podocitos después de 4 semanas de hipertensión, como lo demuestra la expresión anormal de podocalyxin y nephrin, los ratones CSTTg presentaron menos lesiones glomerulares escleróticas (Figura 6a

Figura 5| El bloqueo de la degradación autofagosómica confirmó un aumento del flujo autofágico de podocitos en ratones transgénicos de calpastatina (CSTT). a) Análisis de Western blot de la expresión de LC3. Secuestro 1(SOSTM1)/P62, y ATG5 en podocitos primarios de tipo salvaje (W o CST'9mice. La expresión de tubulina sirve como normalización. Los podocitos fueron tratados o no tratados con bafilomicina A1 (BafA1; 100 nM) durante 4 horas antes de la detención del cultivo. b) Cuantificación de las relaciones LC3-ll/'tubulina y P62/tubulina.n = 10 ratones WT y n = 8 ratones CST'9. Los valores se presentan como gráficos individuales y medias ± SEM. Análisis bidireccional de la varianza pareada para el tratamiento: para LC3-ll/tubulina: genotipo, P= 0,0008;tratamiento, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">riñón-international.org.

Figura 6| La sobreexpresión de calpastatina previene la lesión por podocitos por angiotensina Il (Angel)+ dieta alta en sal (HSD). a,b)

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Imágenes representativas de las secciones de glomérulos teñidas con tricrómica de Masson de ratones de tipo salvaje (WT y transgénicos de calpastatina (CST'9) después de 6 semanas de Angll + HSD. Barras=50 um. (c,d,f,g) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de (c,d) podocalinina (PODXL) y (f,g)nefrina (NPHS1) en WT y CST'9mice después de 6 semanas de cuantificaciones asociadas a Angel +HSD y (e,h). Barras = 50 um. (ii)

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Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión del tumor de Wilm 1 (WT1; verde) y PODXL (rojo) en glomérulos de ratones WT y CST'después de 6 semanas de Angel +HSD y (k) cuantificación asociada del número de células WT1+ por sección glomerular. Los núcleos fueron teñidos con Hoechst (azul). Barras = 50 um. En (e,h,k), los valores se presentan como gráficas individuales y media ± SEM,n = 9 ratones WT y n = 7 ratones CSTTg. Prueba t no emparejada con igual SD:**P=0.0095 en (e),*P=0.0249 en (h), P=0.7891 en (k).

y b)y la expresión preservada de podocalinina y nefrina (Figura 6c-h). Tales diferencias en el fenotipo de podocitos se observaron en una etapa en la que la densidad de los núcleos de podocitos no fue diferente entre WT y ratones CST'g hipertensos (Figura 6i-k).

Del mismo modo, después de 6 semanas de hipertensión, los ratones GFP-LC3 y CST'1 GFP-LC3 presentaron lesión por podocitos, pero las lesiones fueron más prominentes en ratones GFP-LC3 (Figura 7). La relación albúmina-creatinina urinaria fue mayor en ratones GFP-LC3 después de 4 semanas de AnglI + HSD (Figura 7a). El número de podocitos no fue diferente entre los 2 genotipos, pero la expresión de nefrina disminuyó significativamente más en ratones GFP-LC3 (control) (Figura 7b-e). Correlacionando con la protección mediada por calpastatina, el análisis ultraestructural mostró un borrado leve y focal del proceso del pie de podocitos en ratones GFP-LC3 tratados con Angl+ HSD con una mejor preservación del borrado del proceso del pie en ratones CST'g, aunque la cuantificación global del número de procesos del pie por longitud de la membrana basal glomerular (GBM) no fue estadísticamente diferente, muy probablemente porque la lesión por podocitos es focal y segmentaria en nuestro modelo (Figura 7f-h). Cabe destacar que los macrófagos y la infiltración de linfocitos T enriñonesno fueron diferentes entre los grupos (Figura suplementaria S6). Tomados en conjunto, estos resultados demostraron que la calpastatina previno la lesión por podocitos inducida por AngII+ HSD.

La sobreexpresión de calpastatina restaura el flujo autofágico en podocitos de ratones después del tratamiento con Angel + HSD

Finalmente, nos preguntamos si la protección glomerular mediada por calpastatina en el modelo AngII+ HSD implicaba el mantenimiento de la autofagia en los podocitos. Curiosamente, la acumulación de P62 inducida por AnglI + HSD en podocitos se previno en ratones CSTTg y GFP-LC3 CST'g (Figura 8a-d), lo que indica que la calpastatina previno el bloqueo de la autofagia de podocitos. Cabe destacar que el número de puntos GFP+ P62+ de autofagosomas fue similar en podocitos de ratones hipertensos GFP-LC3 y GFP-LC3 CST, lo que sugiere que AnglI + HSD indujo una desaceleración del flujo autofágico de podocitos en lugar de una detención completa (Figura 8e-g).

Predicción in silico del sitio de escisión de calpaína en proteínas de podocitos

Se utilizaron varias herramientas in silico para predecir posibles dianas de calpaína en podocitos (Tablas suplementarias S1 y S2). Se compararon tres bases de datos en línea: GPS-CCD,4CaMPDB,5 y DeepCalpain.° El análisis in silico identificó varias proteínas de podocitos, nefrina y podocina entre ellas, que podrían ser escindidas por calpains. Por lo tanto, la protección glomerular mediada por calpastatina podría estar relacionada con una reducción de la actividad enzimática de la calpaína, lo que llevaría a una degradación reducida de algunas proteínas de podocitos.

Además, al menos 3 proteínas relacionadas con la autofagia son objetivos directos de las calpaínas. ATG5 es escindido por calpaínas, lo que lleva a una alteración en la formación del complejo ATG12-ATG5.57 La administración de inhibidores de calpaína in vivo también evitó la escisión de la proteína de autofagia Beclin-1.5"El análisis in silico del supuesto sitio de escisión en proteínas relacionadas con la autofagia apoya la hipótesis de que la calpaína podría regular la autofagia a través de la escisión enzimática de las proteínas de autofagia.

Expresión de ARNm del retículo endoplásmico (RE) y marcadores de estrés oxidativo en glomérulos de ratones tratados con Angll+ HSD

Se evaluó el estrés del retículo endoplásmico (RE) y el estrés oxidativo mediante PCR cuantitativa en glomérulos durante el tratamiento con AngII +HSD (Tabla 1). Al inicio del estudio, no observamos ningún cambio en la expresión de ARNm de los genes analizados en ratones glomeruli5loxlox (Suplementario de WT y Nphs2.cre Atg5 Figura S7). Después de 6 semanas de hipertensión, los glomérulos de ratones Nphs2. cre Atg5loxlox mostraron diferentes perfiles de ARNm de genes de las vías de estrés ER y estrés oxidativo con mayor expresión de Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl y Hsp90b1 en comparación con los glomérulos WT, lo que sugiere que el agotamiento de la autofagia en los podocitos favoreció el estrés ER inducido por AngII + HSD y el estrés oxidativo. Por el contrario, los glomérulos de ratones CST presentaron una regulación a la baja de varios genes de las vías de estrés ER y estrés oxidativo, así como una disminución de la expresión de algunos genes proapoptóticos (Figura 9).

Tomados en conjunto, estos resultados indican que la sobreexpresión de calpastatina podría prevenir la lesión glomerular al reducir la ER inducida por AngII + HSD y el estrés oxidativo.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, demostramos que en la hipertensión inducida por AngII + HSD, la autofagia de podocitos está marcadamente regulada a la baja. Además, los ratones con deleción específica de podocitos de Atg5 fueron más propensos a la glomeruloesclerosis inducida por AngI + HSD y la pérdida de podocitos, lo que demuestra que la autofagia en los podocitos previene el desarrollo de nefropatía hipertensiva, destacando el papel crítico de la autofagia en la lesión por podocitos inducida por Angl + HSD. Poco se sabe sobre los estímulos extracelulares que regulan la autofagia celular, y estos resultados arrojan luz sobre la regulación fisiopatológica de la autofagia de podocitos por AngII.

En la mayoría de las glomerulopatías humanas, el borrado del proceso del pie de podocitos es un sello distintivo de la lesión glomerular que conduce a la proteinuria. Es probable que la autofagia desempeñe un papel esencial en el mantenimiento de la función de los podocitos porque estas células diferenciadas terminalmente muestran altas tasas de autofagia incluso en ausencia de estrés. Un estudio previo mostró que la autofagia de Angi pro-motes a través de la generación de especies reactivas de oxígeno en una línea celular de podocitos murinos inmortalizada condicionalmente.5 La producción de especies reactivas de oxígeno es de hecho un inductor general de la autofagia en muchos tipos de células y las razones de tal discrepancia con nuestros hallazgos no están claras. A diferencia de este último estudio, utilizamos podocitos murinos cultivados primarios que retienen la expresión de podocina y nefrina y enfoques in vivo y no líneas celulares murinas. Confirmamos informes anteriores de que los podocitos postmitóticos exhiben un nivel inusualmente alto de autofagia constitutiva. La medición del aumento de la cantidad de LC3-II después de la estimulación de AngII en presencia o ausencia de inhibidores lisosomales es necesaria para determinar

si el flujo autofágico está aumentado o bloqueado. Estudios previos han descuidado este fenómeno.

Aquí, utilizamos un modelo hipertensivo basado en perfusión AnglI y HSD. Los podocitos exhiben receptores ATI y están expuestos a péptidos filtrados libres como AngII1,6,26,61-6 Se supone que los efectos renoprotectores observados de la inhibición de RAAS podrían deberse, al menos parcialmente, a un bloqueo de este RAAS específico de poocitos. Asimismo, estudios in vivo

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