Primera parte Los polimorfismos genéticos de MnSOD modifican los impactos de la melamina ambiental sobre el estrés oxidativo y la lesión renal temprana en pacientes con urolitiasis por calcio

Abstracto

La exposición ambiental a la melamina aumenta los riesgos de estrés oxidativo y lesión renal temprana. La superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD), la glutatión peroxidasa y la catalasa pueden proteger los riñones contra el estrés oxidativo y mantener la función normal. Evaluamos si sus polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) podrían modificar los efectos de la melamina. Se incluyeron un total de 302 pacientes diagnosticados de urolitiasis cálcica. Todos los pacientes recibieron muestras de orina de un solo punto durante la noche para medir sus niveles de melamina, biomarcadores urinarios de estrés oxidativo y lesión tubular renal. Los valores medianos se utilizaron para dicotomizar los niveles en alto y bajo. Los sujetos que portaban el alelo T de rs4880 y niveles altos de melamina tenían un riesgo 3,60 veces mayor de niveles altos de malondialdehído que los que portaban el alelo C de rs4880 y niveles bajos de melamina después del ajuste. Los sujetos que portaban el alelo G de rs5746136 y niveles altos de melamina tenían un riesgo 1,73 veces mayor de niveles altos de N-acetil- -D-glucosaminidasa que aquellos que portaban el alelo A de rs5746136 y niveles bajos de melamina. En conclusión, los SNP de MnSOD, rs4880 y rs5746136, influyen en el riesgo de estrés oxidativo y lesión tubular renal, respectivamente, en pacientes con urolitiasis cálcica. En el contexto de niveles elevados de melamina en orina, sus efectos sobre el estrés oxidativo y la lesión tubular renal aumentaron aún más.

Palabras clave

superóxido dismutasa de manganeso; polimorfismo genético; melamina; lesión renal; estrés oxidativo; urolitiasis cálcica.

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Introducción

La melamina es un químico sintético que se utiliza en la fabricación de una variedad de productos comerciales de la vida diaria, incluidos artículos para el hogar, encimeras, telas, pegamentos y retardantes de llama [1,2]. Debido a que tiene un alto contenido de nitrógeno, se ha utilizado incorrectamente en la alimentación animal y la leche para elevar engañosamente el contenido de proteínas [1,2]. Los efectos adversos de la exposición a la melamina atrajeron la atención mundial después de su escandalosa adición a los alimentos para animales, lo que provocó la muerte de miles de animales de compañía en los EE. }} niños y seis muertes en China en 2008 [1,2]. Hasta la fecha, la melamina sigue estando omnipresente en nuestro entorno. Varios estudios han detectado melamina en agua, suelo, cultivos, productos alimenticios diarios y tejidos animales [3–5], y otros la detectaron en la mayoría de las muestras de orina de varias poblaciones generales de diferentes países [6–9].

Después de la ingesta de melamina, el noventa por ciento de su forma original se excretará en la orina dentro de las 24 horas, por lo que los riñones pueden ser más susceptibles a la melamina [1]. Además de los efectos de altas dosis de melamina sobre la nefrotoxicidad aguda en niños en 2008, la exposición prolongada a dosis bajas de melamina se ha relacionado con el riesgo de complicaciones renales, incluida la formación de cálculos y el deterioro de la función renal en adultos [10– 12]. Un mecanismo probable por el que la exposición crónica a dosis bajas de melamina podría conducir a una lesión renal temprana y a la formación de cálculos es su efecto adverso sobre los túbulos renales, como se descubrió en dos de nuestros estudios en humanos en trabajadores de vajillas de melamina [13] y pacientes adultos con urolitiasis cálcica [ 14]. También llevamos a cabo un estudio in vitro utilizando células HK-2 tubulares renales humanas y descubrimos que la melamina podría inducir daño tubular renal al aumentar el estrés oxidativo [15]. En dos estudios humanos recientes, también encontramos que la exposición a la melamina aumentó los biomarcadores urinarios de estrés oxidativo, malondialdehído (MDA) y 8-oxo-20 -desoxiguanosina (8-OHdG), con MDA mediando entre el 36 y el 53 % del efecto total de la melamina en un biomarcador de lesión tubular renal, la N-acetil- -D-glucosaminidasa (NAG) [16]. Esos hallazgos sugieren que la exposición a dosis bajas de melamina ambiental podría aumentar el estrés oxidativo y aumentar el riesgo de lesión renal temprana en humanos.

El estrés oxidativo ocurre cuando la generación de prooxidantes o especies reactivas de oxígeno (ROS) excede la capacidad antioxidante endógena. Nuestros riñones son particularmente sensibles al estrés oxidativo, que se cree que es un factor importante en el inicio, desarrollo y progresión de la mayoría de las enfermedades renales [17,18]. La causa del estrés oxidativo en los riñones puede estar asociada con las interacciones entre las enfermedades médicas y la exposición ambiental a sustancias químicas como la melamina [16]. Se ha descubierto que los sistemas antioxidantes endógenos, como la superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD), la glutatión peroxidasa (GPX1) y la catalasa (CAT), protegen los riñones contra el estrés oxidativo y, posteriormente, ayudan a mantener la función normal [18]. La MnSOD puede descomponer las ROS tóxicas y los aniones superóxido en peróxido de hidrógeno, que luego se convierte en agua y oxígeno no tóxicos mediante GPX1 y CAT en las mitocondrias [18]. Varios polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de esos genes de enzimas antioxidantes se han asociado con diversas enfermedades [19], incluidas las enfermedades renales [20–22].

Dado que el daño renal asociado con tóxicos ambientales puede estar influenciado por factores genéticos [23], es posible que los SNP de los genes de enzimas antioxidantes (p. ej., MnSOD, GPX1, CAT) puedan modificar los efectos de la exposición a la melamina ambiental sobre el riesgo de estrés oxidativo y lesión tubular renal en humanos. Para averiguarlo, seleccionamos cinco SNP candidatos de genes de enzimas antioxidantes (MnSOD: rs4880 y rs5746136, GPX1: rs1800668, CAT: rs1001179 y rs769217), la mayoría de los cuales se han relacionado con enfermedades renales [20–22], para estudiar cada uno de ellos. sus efectos cuando se combinan con la exposición ambiental a la melamina sobre 8-OHdG y MDA, dos biomarcadores de estrés oxidativo, y NAG, un biomarcador de lesión tubular renal, en la orina.

Pastillas de Cistanche tubulosa y Cistanche

Materiales y métodos

1. Sujetos

En total, se inscribieron 309 pacientes diagnosticados con urolitiasis cálcica del tracto urinario superior entre noviembre de 2010 y enero de 2015. Los diseños detallados del estudio y los protocolos para su inclusión se describieron anteriormente [14,16]. En resumen, todos los pacientes procedían de hospitales afiliados a la Universidad Médica de Kaohsiung en el suroeste de Taiwán. Los pacientes elegibles fueron individuos mayores o iguales a 20 años que habían sido diagnosticados con urolitiasis en el tracto urinario superior por radiografía o ecografía, y que habían proporcionado muestras de cálculos con componentes de calcio confirmados por análisis de espectroscopia infrarroja (Spectrum RX I Fourier Transform -Sistema de infrarrojos, PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). En ninguno de los participantes se encontró por rayos X que tuviera cálculos radiolúcidos o por evaluación clínica que tuviera cálculos de ácido úrico o cistina.

Los pacientes fueron excluidos si tenían antecedentes de infección crónica del tracto urinario, diarrea crónica, gota, hiperparatiroidismo, acidosis tubular renal, insuficiencia renal o cáncer. También se excluyó a cualquier sujeto que hubiera tomado regularmente vitamina D, suplementos de calcio, diuréticos o citrato de potasio más de una vez por semana dentro de los seis meses anteriores al diagnóstico de urolitiasis o entrevista. El protocolo del estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de KMUH y todos los pacientes elegibles proporcionaron formularios de consentimiento informado por escrito firmados. Este estudio siguió las pautas de STREGA [24] (consulte la Tabla de materiales complementarios S1).

2. Recolección de Datos Clínicos y Muestras Biológicas

Al ingreso, a todos los participantes se les proporcionó sangre y muestras de orina de la mañana de la primera evacuación de un punto después del ayuno nocturno y antes de cualquier tratamiento de urolitiasis para análisis bioquímicos y genéticos. También respondieron un cuestionario estructurado para recopilar sus datos demográficos, historial médico y consumo de sustancias (cigarrillos, alcohol y betel quid) [14,16]. Los participantes se definieron como fumadores de cigarrillos, bebedores de alcohol o masticadores de betel si habían fumado regularmente más de o igual a 10 cigarrillos por semana, habían consumido cualquier bebida alcohólica más de o igual a 1 vez por semana, o habían masticado más de o igual a 10 cigarrillos por semana. equivalente a 7 libras de betel por semana, respectivamente, durante al menos seis meses. Los usuarios actuales eran aquellos que aún practicaban los hábitos anteriores dentro del año anterior al diagnóstico de urolitiasis o la entrevista [11,25].

La información clínica, incluida la ubicación de los cálculos, el número de cálculos, el diámetro de los cálculos y los episodios de cálculos, también se recopiló mediante un cuestionario y un urólogo (C.-CL) que desconocía la exposición de interés los revisó más a fondo utilizando los expedientes médicos de los pacientes, incluidos melamina y biomarcadores de estrés oxidativo (8-OHdG y MDA) y lesión tubular renal (NAG) en orina y genotipado de genes de enzimas antioxidantes.

Cápsulas de Cistanche

3. Análisis de melamina, biomarcadores de estrés oxidativo (MDA y 8-OHdG) y lesión tubular renal (NAG) en orina

La melamina en orina se midió utilizando un método de cromatografía líquida isotópica-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (API40{{20}}0Q, Applied Biosystems/MDS SCIEX , Concord, Vaughan, ON, Canadá) [13]. La MDA urinaria se midió mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia (HPLC-FL) en una columna de fase reversa (Luna C18, 250 × 4,6 nm) [26]. La 8-OHdG urinaria se midió utilizando un método validado para la extracción en fase sólida (SPE) en línea LC-MS/MS [27]. Los métodos detallados se describieron previamente [14, 16]. Los límites de detección (LOD) para melamina en orina y biomarcadores de estrés oxidativo fueron 0,4 ng/ml para melamina, 0,02 µmol/L para MDA y 0,01 ng/mL para 8-OHdG. Todas las mediciones urinarias de MDA y 8-OHdG fueron detectables. Por el contrario, 31 (10,0 por ciento) de las 309 mediciones de melamina en orina estaban por debajo del LOD y se sustituyeron como LOD/√ 2.

La NAG urinaria se midió utilizando un kit de ensayo NAG (Diazyme Laboratory, Poway, CA, EE. UU.) [13,14]. Todas las mediciones de NAG en orina fueron detectables. La creatinina urinaria se analizó mediante espectrofotometría (U-2000; Hitachi, Tokio, Japón) ajustada a una longitud de onda de 520 nm para medir la reacción creatinina-picrato [14]. La medición de todos los parámetros bioquímicos anteriores fue realizada por dos técnicos de laboratorio diferentes que desconocían los hallazgos, el diseño del estudio y la información de los participantes del otro.

4. genotipado de cinco SNP

El ADN se extrajo de sangre completa periférica utilizando un kit de aislamiento de ADN Puregene (Gentra Systems Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.). Los cinco SNP (MnSOD-rs4880, MnSODrs5746136, GPX1-rs1800668, CAT-rs1001179 y CAT-rs769217) se analizaron utilizando un kit de genotipado de SNP de ensayo bajo demanda para un ensayo de discriminación alélica TaqMan 5' (Applied Biosystems , Foster City, CA, EE. UU.). Brevemente, los ensayos de amplificación de SNP que incluían 10 ng de ADN de muestra en 25 µL de solución de reacción contenían 12,5 µL de 2× TaqMan®Universal PCR Mix (Applied Biosystems), mientras que 1,25 µL de reactivo de ensayo predesarrollado a partir del producto de genotipado de SNP (Applied Biosystems) Biosystems) contenía dos cebadores. Se realizaron dos sondas MCB-Taqman siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron utilizando un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7500 (Applied Biosystems) [28,29]. Estos genotipos se confirmaron mediante secuenciación directa después del genotipado a gran escala. Al azar, ~10 por ciento de las muestras del estudio (30 casos) se repitieron para el control de calidad, y los resultados mostraron una precisión del 100 por ciento.

Los beneficios de la Cistanche

5. Análisis estadísticos

Los datos cuantitativos se expresaron como medias ± desviaciones estándar (DE) o medianas con rangos intercuartílicos (RIC), y los datos categóricos se presentaron como números (n) y porcentajes. El equilibrio de Hardy-Weinberg para la distribución de genotipos se comprobó mediante la prueba de chi-cuadrado.

Los niveles de melamina en orina y los biomarcadores urinarios (MDA, 8-OHdG, NAG) se corrigieron con los valores de creatinina en orina antes de realizar más análisis. Después de la corrección, los biomarcadores urinarios de estrés oxidativo (MDA y 8-OHdG) y lesión tubular renal (NAG) se dicotomizaron en alto o bajo utilizando sus valores medianos [14,16]. Primero se utilizaron modelos de regresión logística simple para evaluar las asociaciones entre genotipos de genes de enzimas antioxidantes y biomarcadores urinarios de estrés oxidativo y lesión tubular renal. Si se observó una relación significativa en el análisis inicial, los efectos combinados entre los genotipos de genes de enzimas antioxidantes y los niveles de melamina en orina dicotomizados por valores medianos se probaron más mediante análisis de regresión logística múltiple después de ajustar por covariables, como edad, sexo, IMC, nivel educativo. nivel, hábitos personales, número de piedras, tamaño de piedra, ubicación de piedra y comorbilidades. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico SAS. Todos los valores de p fueron bilaterales y se consideraron significativos si<0.05.

6. Análisis de sensibilidad

Para examinar la solidez de nuestros hallazgos, realizamos análisis de sensibilidad para comparar los resultados cuando los niveles de melamina en orina se dividieron en terciles. Además, también comparamos los hallazgos utilizando un nuevo método de estandarización ajustada por covariables más el ajuste de creatinina para corregir la concentración de orina y las estructuras de confusión complicadas [14,30].

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Chia-Chu Liu 1,2,3,4, Chia-Fang Wu 1,5, Yung-Chin Lee 2,3,6, Tsung-Yi Huang 2, Shih-Ting Huang 1,7, Hsun-Shuan Wang 6, Jhen-Hao Jhan 6 , Shu-Pin Huang 2,3, Ching-Chia Li 2,3, Yung-Shun Juan 2,3 , Tusty-Jiuan Hsieh 1,7 , Yi-Chun Tsai 1,8,9, Chu- Chih Chen 1,10 y Ming-Tsang Wu 1,11,12,13,

1 Centro de Investigación de Medicina Ambiental, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán; ccliu0204@gmail.com (C.-CL); cfwu27@nuu.edu.tw (C.-FW); u107800006@kmu.edu.tw (S.-TH); hsiehjun@kmu.edu.tw (T.-JH); 920254@kmuh.org.tw (Y.-CT); ccchen@nhri.edu.tw (C-CC)

2 Departamento de Urología, Hospital de la Universidad Médica de Kaohsiung, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán; 890197@kmuh.org.tw (Y.-CL); 970417@kmuh.org.tw (T.-YH); shpihu@kmu.edu.tw (S.-PH); 850144@kmuh.org.tw (C.-CL); 840066@kmuh.org.tw (Y.-SJ)

3 Departamento de Urología, Facultad de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán

4 Departamento de Urología, Hospital de Pingtung, Ministerio de Salud y Bienestar, Ciudad de Pingtung 900, Taiwán

5 Programa de Maestría Internacional en Medicina Traslacional, Universidad Nacional Unida, Miaoli 360, Taiwán

6 Departamento de Urología, Hospital Municipal Siaogang de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 812, Taiwán; 940199@kmuh.org.tw (H.-SW); 1030398@kmuh.org.tw (J.-HJ)

7 Instituto de Posgrado en Medicina, Facultad de Medicina, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán

8 Departamento de Medicina Interna, Divisiones de Nefrología y Medicina General, Hospital Universitario Médico de Kaohsiung, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán

9 Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán

10 División de Bioestadística y Bioinformática, Instituto de Ciencias de la Salud de la Población, Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Miaoli 350, Taiwán

11 Medicina Ambiental y Ocupacional e Instituto de Graduados en Medicina Clínica, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán

12 Departamento de Medicina Familiar, Hospital de la Universidad Médica de Kaohsiung, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán

13 Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Médica de Kaohsiung, Ciudad de Kaohsiung 807, Taiwán