La AKT activada por preacondicionamiento controla la tolerancia neuronal a la isquemia a través de la vía MDM2-p53Ⅱ

3. Discusión

Nuestros resultados revelan que la activación de la vía de señalización PI3K/AKT mediada por IPC desencadena la TI neuronal al controlar el complejo MDM2-p53 en las neuronas corticales primarias. Primero confirmamos la eficiencia del preacondicionamiento en términos de neuroprotección [33,39–41] utilizando un modelo experimental IPC validado.

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Descubrimos que la IPC experimental inducida por una breve privación de oxígeno y glucosa (OGD) (20 min) seguida de 2 h de reoxigenación resultó en neuroprotección, como lo demuestra la prevención de la apoptosis neuronal y la activación de caspasa-3 inducida por OGD (90 min) seguido de 4 h de reoxigenación (OGD/R). Mostramos que IPC reduce la activación de caspasa-3 en las neuronas corticales, lo que se correlaciona con menos apoptosis después de un insulto isquémico posterior y más severo.

El equilibrio entre las señales pro y antiapoptóticas es fundamental para asegurar la supervivencia neuronal después de la isquemia [3,33,38,42–44]. Aunque se ha demostrado la relevancia de tales eventos en modelos de accidente cerebrovascular in vivo tanto hemorrágico como isquémico [43,45], los mecanismos que regulan estas vías de señalización aún no se comprenden completamente en el contexto de la tolerancia isquémica. El papel de la AKT antiapoptótica y sus vías relacionadas se ha estudiado ampliamente en células cancerosas [46,47] y tejido cerebral [38,48]; sin embargo, hasta el momento, el papel de la vía de señalización AKT/MDM2-p53 en la tolerancia neuronal mediada por IPC contra la lesión isquémica sigue siendo difícil de alcanzar.

Aquí, encontramos que la activación de la vía de señalización PI3K/AKT causada por IPC promueve la fosforilación de MDM2 en Ser166, lo que desencadena su translocación nuclear y la estabilización de proteínas, evitando la apoptosis inducida por p53-a través de la activación de caspasa-3 después de la isquemia. La activación de AKT a través de la fosforilación promueve la supervivencia neuronal [24,49] y puede contribuir a la inducción de TI [25,50]. Nuestros resultados muestran que la abundancia relativa de la proteína AKT no cambia bajo estímulos isquémicos o de precondicionamiento. Curiosamente, encontramos que la fosforilación temprana de AKT mediada por PI3K en Ser473 previene la estabilización de p53 inducida por isquemia en las neuronas precondicionadas.

El efecto no se debió a modificaciones en los niveles de ARNm de p53 [33,34,44] sino a la disminución de los niveles de proteína p53 debido a IPC antes de OGD/R. Dado que MDM2 es el principal regulador de la estabilización de p53 y también es un objetivo directo de AKT, nuestros resultados señalan el papel de la vía de señalización AKT/MDM2-p53 en la tolerancia neuronal a la isquemia. El ARNm de MDM2 aumenta rápidamente después de la OGD [34], pero la actividad de MDM2 está controlada principalmente por modificaciones postraduccionales, particularmente la fosforilación [51]. De acuerdo con esto, encontramos que una vez activada por fosforilación después de IPC, AKT, a su vez, fosforila MDM2 en el residuo Ser166, que se encuentra cerca de la señal de localización nuclear [52], y este efecto se mantiene después de la lesión OGD/R.

Nuestros resultados muestran que la fosforilación de MDM2 en Ser166 es suficiente para ejercer el efecto neuroprotector mediado por IPC a través de la desestabilización de p53. Por lo tanto, aquí, identificamos una activación dependiente del tiempo de la vía AKT / MDM2-p53 después de una lesión isquémica y, de hecho, demostramos que la AKT activada por IPC desencadenó la translocación nuclear de MDM2 ectópico, así como la estabilización de proteínas endógenas.

Además, AKT permanece activa dentro del núcleo, donde PI3K también podría migrar en respuesta al estrés oxidativo y luego explicar la fosforilación de AKT [53]. La inhibición de la fosforilación de AKT mediada por PI3K o la caída de AKT promueve la retención de la proteína MDM2 en el citoplasma y evita la fosforilación de MDM2 en Ser166, así como la neuroprotección mediada por IPC contra la apoptosis neuronal inducida por isquemia. Por el contrario, mostramos que la AKT activa se une a la proteína nuclear MDM2.

Como consecuencia, la AKT activa promueve tanto la fosforilación de MDM2 como su estabilización nuclear, lo que contribuye a la neuroprotección mediada por IPC. Nuestros resultados revelan que la neuroprotección promovida por IPC dependía de la activación de AKT mediada por PI3K, que fosforilaba MDM2 en Ser166, promoviendo la acumulación nuclear de MDM2 después de un insulto isquémico.

En consecuencia, la inhibición de PI3K/AKT por wortmannin o el agotamiento de AKT por siRNA abolió la neuroprotección promovida por IPC, lo que condujo a la estabilización de p53 y la subsiguiente apoptosis neuronal después de la isquemia. Por lo tanto, nuestros resultados ayudan a aclarar el papel esencial de la activación dependiente de IPC de la vía AKT-MDM2 en la supervivencia neuronal frente a la lesión isquémica.

La proteína p53 está implicada en el control de la muerte/supervivencia neuronal determinando el pronóstico en pacientes con accidente cerebrovascular [34,42,54], así como en pacientes con AIT [3]. La estabilización de P53 compromete la neuroprotección mediada por el precondicionamiento frente a la lesión por isquemia/reperfusión [33]. La interacción MDM2-p53 será, por lo tanto, crítica para la supervivencia neuronal en este contexto [34] y para la tolerancia mediada por IPC contra la lesión isquémica [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G en el promotor de MDM2 determina la expresión de MDM2 y, a su vez, modula la recuperación de los pacientes que sufren un ictus [34].

Además, observamos que un SNP del gen Tp53 (rs1042522) modula la estabilización de p53 mitocondrial y la tolerancia neuronal a la isquemia al tiempo que predice la recuperación funcional de los pacientes que sufren un AIT antes del accidente cerebrovascular [3]. Por tanto, el control de las vías apoptóticas de p53 será fundamental para asegurar el efecto neuroprotector de IPC.

Estos resultados proporcionan un enfoque traslacional al estudio que podría implementarse en el futuro en beneficio de los pacientes, y plantean la vía de señalización PI3K/AKT–MDM2–p53 como un objetivo esencial para las estrategias de TI promovidas por el preacondicionamiento en el accidente cerebrovascular isquémico. En resumen, demostramos que la vía de señalización PI3K/AKT mejorada con IPC promueve la fosforilación de MDM2 en Ser166, lo que conduce a la translocación nuclear de MDM2 y su estabilización, lo que desencadena la TI neuronal al promover la desestabilización de p53 y la posterior inactivación de la muerte apoptótica inducida después de un insulto isquémico.

Nuestros resultados destacan los beneficios potenciales de la activación temprana de AKT en la tolerancia neuronal mediada por IPC, que regula la vía apoptótica MDM2-p53 bajo lesión isquémica. Estos hallazgos resaltan una oportunidad para comprender los mecanismos que regulan la vía de señalización neuronal AKT-MDM2-p53 para desarrollar nuevas estrategias neuroprotectoras para los trastornos relacionados con TI.

4. Materiales y Métodos

4.1. Cultivos primarios de neuronas corticales

Los cultivos neuronales se prepararon a partir de cortezas de embrión de ratón (14.5E) C57Bl/6J o p53-null (Tp53-/-, B6.129S2, The Jackson Laboratory). Las neuronas se sembraron a 1,8 × 105 células/cm2 en un medio Neurobasal suplementado con B27 al 2 % y glutamina 2 mM (Invitrogen, Madrid, España) y se incubaron a 37 ◦C en una atmósfera humidificada que contenía CO2- al 5 % [ 55].

4.2. Modelos de privación y preacondicionamiento de glucosa en oxígeno

Después de 9–1{{10}} días in vitro (DIV), las neuronas se expusieron a privación de oxígeno y glucosa (OGD) incubando las células a 37 ◦C durante 90 min en una incubadora equipado con una esclusa de aire y continuamente gaseado con 95 por ciento de N2/5 por ciento de CO2. El medio de incubación (solución de Hanks tamponada sin glucosa: KCl 5,26 mM, KH2PO4 0,43 mM, NaCl 132,4 mM, NaHCO3 4,09 mM, Na2HPO4 0,33 mM, CaCl2 2 mM y HEPES 20 mM, pH 7,4) se gaseó previamente con N2 al 95 %. /5 por ciento de CO2 durante 30 min. En estas condiciones, las concentraciones de oxígeno en el medio de incubación fueron de 6,7 ± 0,5 µM medidas con un electrodo de oxígeno tipo Clark [56,57].

Cuando estaba indicado, las neuronas se expusieron a preacondicionamiento isquémico (IPC; OGD corto durante 20 min seguido de 2 h de reoxigenación) antes de la isquemia prolongada posterior (OGD, 90 min) y 4 h de reoxigenación (IPC más OGD/R) (Figura S1B ). Paralelamente, las neuronas se incubaron en normoxia (Nx) a 37 ◦C en una atmósfera humidificada de 95 por ciento de aire/5 por ciento de CO2 o preacondicionamiento isquémico (IPC). Cuando se indicó, las neuronas se incubaron 30 min antes de la IPC en solución de Hanks tamponada (pH 7,4), en ausencia o presencia de wortmannin (100 nmol/L), como se describió anteriormente [19].

4.3. Transfecciones celulares

Se transfectaron neuronas (8 DIV) o células HEK-293T con un vector de plásmido que expresaba Mdm2 marcado con YFP del promotor humano MDM2. MDM2p/Mdm2-YFP fue un regalo de Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plásmido n.º 53962, Watertown, MA, EE. UU.) [58]. Cuando fue necesario, se utilizó un vector vacío (pYFP) como control en las mismas condiciones. La transfección del plásmido se realizó utilizando Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se transfectaron con 1,5 µg/µL de los vectores plasmídicos y se usaron después de 24 h.

La eliminación de AKT en 6 neuronas DIV se logró mediante la transfección con pequeños ribonucleótidos de doble cadena de interferencia (ARNip). Las secuencias objetivo fueron las siguientes: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisentido: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (ratón, s62216, correspondiente a los nucleótidos 1006–1025, número de acceso de GenBank NM_009652) [59]. Como control negativo, utilizamos Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Todos los siRNA se adquirieron de Ambion®, Invitrogen® y Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Alemania). De acuerdo con el grado de eliminación de proteínas, se estimó que la eficiencia de la transfección de siRNA era del 70 al 80 por ciento a los 3 días posteriores a la transfección. Para los experimentos de silenciamiento, las neuronas se transfectaron con siRNA (10 nM) usando Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las neuronas se incubaron adicionalmente en un medio Neurobasal durante 72 h antes de su uso.

4.4. Detección por citometría de flujo de muerte celular apoptótica

Las neuronas se separaron cuidadosamente de las placas utilizando sal tetrasódica de EDTA 1 mM en PBS (pH 7,4) y se tiñeron con anexina V/APC y 7-AAD, exactamente como se describió anteriormente [55].

4.5. Ensayo de actividad de caspasa-3

La actividad de caspasa-3 se evaluó en lisados ​​celulares [33] y de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit de ensayo fluorimétrico CASP3F de SIGMA y se leyó en emisión a una longitud de onda de 405 nm. El método se basa en la liberación de la fracción fluorescente 7-amino4-metil cumarina (AMC). La concentración de AMC se calcula utilizando un estándar de AMC.

4.6. Ensayo de inmunotransferencias y coinmunoprecipitación

Las neuronas se lisaron en tampón que contenía 1 % de SDS, 2 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 12,5 mM de Na2HPO4 y 1 % de Triton X-100 (NP40: 1 % de NP40, EDTA diK más 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM y 10 por ciento de glicerol) complementado con inhibidores de la fosfatasa (1 mM Na3VO4 y 50 mM NaF) e inhibidores de la proteasa (100 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 50 µg/ml de antipapaína, 50 µg/ml de pepstatina, 50 µg/ml de amastatina, 50 µg/ml de leupeptina, 50 µg/ml de bestatina y 50 µg/ml de inhibidor de tripsina de soja), almacenado en hielo durante 30 min y hervido durante 5 min. Las alícuotas de los extractos lisados ​​se sometieron a gel de poliacrilamida SDS (MiniProtean®, Bio-Rad) y se transfirieron con anticuerpos durante la noche a 4 ◦C. Los anticuerpos utilizados fueron anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-caspasa escindida-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU.), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; también detecta YFP) (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania) y antiGAPDH (Ambion, Cambridge, Reino Unido) durante la noche a 4 ◦C. Después de la incubación con IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pierce, Thermo Scientific) o IgG anti-ratón de cabra (Bio-Rad), las membranas se incubaron inmediatamente con quimioluminiscencia mejorada SuperSignal West Dura (Pierce) durante 5 minutos antes de la exposición a Kodak. película XAR-5 durante 1 a 5 min y se escanearon los autorradiogramas. Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ 1.48v, como se describió anteriormente [60].

Para el ensayo de co-inmunoprecipitación, las neuronas se lisaron en tampón enfriado con hielo que contenía Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, NP al 1 por ciento -40) ​​complementado con inhibidores de fosfatasa descritos anteriormente. Después de eliminar los desechos mediante centrifugación, los lisados ​​neuronales (100 mg) se incubaron con 1 mg del anticuerpo durante 24 h a 4 ◦C seguido de la adición de 10 ml de proteína A-agarosa (GE Healthcare Life Sciences) durante 2 h a 4 ºC. ◦C. Los inmunoprecipitados se lavaron exhaustivamente con tampón de lisis y se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados [61]. Las abundancias relativas de proteínas se muestran en la Figura S1. Las transferencias completas y las exploraciones en gel se incluyen en la Figura S3.

4.7. Inmunocitoquímica y Análisis de Imagen

Las neuronas se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y se fijaron con paraformaldehído al 4 % (p/v, en PBS) durante 30 min y se inmunoteñeron con anti-fosfoAKT de conejo (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, EE. UU.), anti-MDM2 de ratón (2A10, ab-16895), anti-MAP2 de ratón (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) [55], anti-p53 de ratón (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, EE. UU.) y anti-GFP (1:1000; ab290; también validado para detectar YFP). El inmunomarcaje se detectó utilizando anticuerpos secundarios anti-IgG-Cy3 de conejo o IgG-Cy2 anti-ratón (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, Reino Unido).

Los núcleos se tiñeron con 40,6-diamidino-2fenilindol (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Los cubreobjetos se lavaron, se montaron en el reactivo antidecoloración SlowFade light (Invitrogen) en portaobjetos de vidrio y se examinaron con un microscopio (Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E, (NY, EE. UU.) equipado con un objetivo de 40x, un iluminador de fibra precentrado Nikon Intensilight C-HGFI, y una cámara digital con dispositivo de carga acoplada en blanco y negro Hamamatsu ORCAER o un microscopio confocal láser de barrido ("Disco giratorio" Roper Scientific Olympus IX81, Tokio, Japón) con tres láseres de 405, 491 y 561 nm, equipado con un objetivo de inmersión en aceite PL Apo de 40×, 63× y 100× para imágenes de alta resolución y una cámara digital para dispositivos Evolve Photometrics.

Todos los ajustes del microscopio se configuraron para recolectar imágenes fluorescentes por debajo de la saturación y se mantuvieron constantes para todas las imágenes tomadas en el experimento. Las imágenes se analizaron con el software ImageJ 1.48v (Institutos Nacionales de Salud). El porcentaje de neuronas p(Ser473)AKT plus y p53 plus y la cuantificación de la intensidad máxima de fluorescencia de proteína de p(Ser473)AKT y p53 se muestran en la Figura S2A. En neuronas transfectadas con MDM2-GFP, la distribución nucleocitoplasmática de MDM2-GFP se calculó como la relación entre la fluorescencia media nuclear y la fluorescencia media citoplasmática de MDM2 endógeno, medida en 24 neuronas (seis neuronas por condición en cuatro cultivos neuronales diferentes) (Figura S2B) [62].

Para cuantificar la intensidad de fluorescencia nuclear máxima de la tinción de MDM2 endógeno y pSer473AKT, se midieron 40 neuronas (10 neuronas por condición en cuatro cultivos diferentes) (Figura S2C), como se describió anteriormente [44]. En los perfiles de intensidad transversales representativos que se muestran en la Figura 5B, el porcentaje de p(Ser473)AKT y MDM2 indicado debajo de cada condición se cuantificó como fluorescencia media nuclear. En todos los casos, los núcleos se identificaron mediante tinción DAPI. La intensidad máxima de fluorescencia de MDM2 nuclear en neuronas tratadas con wortmannin o siAkt se muestra en la Figura S2D.

4.8. Análisis estadístico

Los resultados experimentales se evaluaron mediante un análisis de varianza unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Bonferroni, utilizada para comparar valores entre múltiples grupos. Los resultados se expresan como medias ± SEM. Se utilizó la prueba t de Student para las comparaciones entre dos grupos de valores. En todos los casos se consideró significativo p < 0.05 (* p < 0,05 frente a Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

¿Cómo protege Cistanche a las neuronas?

Hay alguna evidencia que sugiere que Cistanche puede proteger las neuronas al reducir la apoptosis (muerte celular programada) y promover la supervivencia neuronal. La apoptosis es un proceso natural que se produce en el cuerpo para eliminar las células dañadas o no deseadas, pero puede ser perjudicial cuando se produce de forma excesiva o inadecuada. Cistanche se ha encontrado para inhibir la apoptosis en estudios de laboratorio, y este efecto puede ayudar a proteger las neuronas del daño.

Además, Cistanche contiene varios compuestos bioactivos que han demostrado tener efectos neuroprotectores. Por ejemplo, contiene equinacósido, que se ha demostrado que protege a las neuronas del estrés oxidativo y la inflamación. También contiene acteósido, que se ha encontrado que tiene propiedades antiinflamatorias y antioxidantes.

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