Efectos protectores de la quercetina sobre el daño epitelial tubular inducido por estrés oxidativo en el modelo experimental de hiperoxaluria en ratas

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Resumen: Antecedentes y Objetivos: Los más comunescálculos renalesson cálculos de calcio y los cálculos de oxalato de calcio (CaOx) son el tipo más común de cálculos de calcio. La hiperoxaluria es un factor de riesgo esencial para la formación de estos cálculos.quercetinaes un polifenol con efectos antioxidantes, antiinflamatorios y muchos otros efectos fisiológicos. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto protector de la quercetina en la nefrolitiasis inducida por hiperoxaluria. Materiales y métodos: ratas macho Wistar-Albino que pesaban 250-300 g (n=24) se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos: Control (n=8), etilenglicol (EG) (n{{6) }}) y EG más quercetina (n=8). Se administró una solución de agua y EG al uno por ciento a todas las ratas, excepto al grupo de control, como agua potable durante cinco semanas. La solución de quercetina y agua se administró al grupo de EG más quercetina por sonda oral a una dosis de 10 mg/kg/día. Se analizaron los niveles de malondialdehído (MDA), catalasa (CAT), urea, calcio y oxalato en muestras de sangre y orina. Evaluaciones histopatológicas y análisis inmunohistoquímicos paraestrés oxidativoyinflamaciónSe realizaron indicadores de proteína quinasa activada por mitógeno p38 (p38-MAPK) y factor nuclear kappa B (NF-kB) en tejidos renales. Resultados: Los niveles de MDA fueron significativamente más bajos en el grupo tratado con quercetina que en el grupo tratado con EG (p=0.001). Aunque los niveles de CAT fueron más altos en el grupo tratado con quercetina que en el grupo al que se administró EG, no fueron significativamente diferentes entre estos grupos. La expresión de p38 MAPK fue significativamente menor en el grupo tratado con quercetina que en el grupo EG (p<0.004). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" quercetin="" and="" eg="" groups="" in="" terms="" of="" nf-kb="" expression.="" conclusions:="" we="" conclude="" that="" hyperoxaluria="" activated="" the="" signaling="" pathways,="" which="" facilitate="" the="" oxidative="" processes="" leading="" to="" oxalate="" stone="" formation="" in="" the="" kidneys.="" our="" findings="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" damage="" due="" to="" hyperoxaluria.="" these="" results="" imply="" that="" quercetin="" can="" be="" considered="" a="" therapeutic="" agent="" for="" decreasing="" oxalate="" stone="" formation,="" especially="" in="" patients="" with="" recurrent="" stones="" due="" to="">

Palabras clave: oxalato de calcio; hiperoxaluria; estrés oxidativo; quercetina

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1. Introducción

La formación de cálculos urinarios involucra varios factores, incluida la concentración de iones que causan la formación de cálculos, el pH de la orina, las tasas de flujo urinario y la anatomía del tracto urinario[l]. Aproximadamente el 75 por ciento de los cálculos renales son cálculos de calcio, y los cálculos de oxalato de calcio (CaOx) son los cálculos de calcio que se encuentran con más frecuencia [2,3]. Se sabe que la hiperoxaluria es un factor de riesgo esencial para la formación de estos cálculos. El aumento resultante en la concentración de oxalato urinario induce la formación de cálculos a través de iones de calcio y oxalato para formar cristales de CaOx a pH fisiológico. Se demostró que el exceso de concentración de oxalato daña las células del túbulo renal a través de los radicales libres de oxígeno y el aumento de la peroxidación lipídica y este proceso facilita tanto la formación de cristales de CaOx como su unión al epitelio tubular renal [4,5].

A pesar de las mejoras en el tratamiento de los cálculos renales, se informaron tasas de recurrencia del 10 % en un año, del 35 % en cinco años y del 50 % en diez años para los cálculos de oxalato de calcio [6,7]. Estas altas tasas de recurrencia han llevado a los investigadores a explorar posibles métodos preventivos para la recurrencia de los cálculos de CaOx [6-8].

quercetinaes un flavanol que se encuentra en varios alimentos, incluidos los frutos secos, el vino, las semillas y algunas frutas y verduras [8]. Además de sus potentes actividades antioxidantes, eliminadoras de radicales y antiinflamatorias, también tiene actividades antibacterianas, antivirales, gastroprotectoras e inmunomoduladoras [8-10].

Se demostró un aumento del estrés oxidativo en pacientes con cálculos renales [11]. Como tal, se informó un menor riesgo de nefrolitiasis en pacientes con niveles altos de antioxidantes que en aquellos con niveles bajos de antioxidantes [12]. Se demostró que las placas de Randall, que se cree que se forman debido al estrés oxidativo, tienen un papel esencial en la recurrencia de cálculos de CaOx [13]. Por lo tanto, la inhibición de la formación de placa de Randall y el estrés oxidativo pueden ser beneficiosos para prevenir la recurrencia de cálculos.

Este estudio investigó el posible efecto protector de la quercetina en la nefrolitiasis y la nefrocalcinosis al determinar su impacto sobre el estrés oxidativo y la inflamación en un modelo de hiperoxaluria en ratas.

2. Materiales y métodos

2.1.Animales

En este estudio experimental, realizado en el Laboratorio Experimental de Animales de la Universidad Süleyman Demirel, se utilizaron ratas macho Wistar-Albino que pesaban 250-300 g (n =24). Las ratas se alojaron en una habitación mantenida a 25±1 grados con una humedad relativa del 55 por ciento. Se les proporcionó alimento y agua ad libitum. El estudio se realizó después de recibir la aprobación del Comité de Revisión Ética de Experimentos con Animales de la Universidad Süleyman Demirel (número de aprobación: 33/01). Todos los experimentos se realizaron en base a los principios éticos informados en la Directiva de la Unión Europea 2010/63/EU para experimentos con animales.

2.2. quimicos

El etilenglicol (EG) se adquirió de Merck Chemicals (Darmstadt, Alemania), mientras que la quercetina se adquirió de Sigma Chemicals (St. Louis, MO, EE. UU.).

2.3. Modelo de nefrolitiasis inducida por hiperoxaluria y administración de quercetina

Las ratas se dividieron aleatoriamente en tres grupos; grupos de control (n{{{{10}}}}), EG (n =8) y EG más quercetina (n =8). Todas las ratas, excepto el grupo de control, recibieron una solución de agua EG al 1 por ciento como agua potable durante cinco semanas [14]. Se administró una dosis de 10 mg/kg/día de la solución de agua y quercetina a las ratas en el grupo de EG más quercetina por sonda oral. Se recolectaron muestras de orina de veinticuatro horas de los animales el día 0 antes de administrar EG o quercetina y los días 15 y 30. Las ratas se anestesiaron al final del período experimental de cinco semanas y se recolectaron muestras de sangre de la cava inferior. vena. Luego, se sacrificaron las ratas y se extirparon rápidamente ambos riñones. Los riñones derechos se incluyeron en formaldehído tamponado neutro al 10 por ciento. Los riñones izquierdos se lavaron con una solución fría de cloruro de sodio al 0,9 por ciento y se almacenaron a -80 grados hasta la homogeneización.

2.4.Análisis bioquímicos

El análisis de los niveles de oxalato en plasma se realizó mediante la técnica previamente descrita por Ladwig et al. [15]. El nivel de oxalato en orina se determinó mediante el kit enzimático Trinity Biotech Oxalate (Trinity Biotech pic, St. Louis, MO, EE. UU.). La catalasa (CAT) es una enzima antioxidante [10,16]. La actividad de la catalasa se midió por el método Aebi [16]. Los niveles de proteína sobrenadante se analizaron mediante albúmina de suero bovino utilizando el método de Lowry como se describe en el protocolo estándar [17]. También se analizaron los niveles de malondialdehído (MDA), ya que la MDA se considera un biomarcador del estrés oxidativo [9]. Los niveles de malondialdehído se midieron espectrofotométricamente según el método propuesto por Ohkawa et al. [18] La detección de proteínas se realizó mediante el método descrito por Lowry et al. [17]. Los niveles de creatinina en plasma y orina se midieron por colorimetría según el método de Jaffe; las concentraciones de urea en plasma se analizaron por métodos cinético-colorimétricos y reacciones de ureasa y glutamato deshidrogenasa. Por el contrario, los niveles de calcio en orina se midieron mediante un autoanalizador a través de Schwarzenbach y el método del complejo o-cresolftaleína. Se recogieron muestras de sangre y orina cronometradas para calcular el aclaramiento de creatinina. El volumen de orina (V) se expresó en ml, mientras que los niveles de creatinina sérica y urinaria se expresaron en mg/dl. El aclaramiento de creatinina se calculó según la fórmula:

Aclaramiento de creatinina (mL/min)=U(mg/dL)× V(mL/min)/S (mg/dL)[V:Volumen de orina (mL/min), U:Creatinina en orina (mg/ dL), S: creatinina sérica (mg/dL)]

2.5. Análisis histopatológicos

Los riñones derechos se incrustaron en formaldehído tamponado neutro al 10 por ciento (Merck-KGaA, Darmstadt, Alemania). El procesamiento del tejido se inició después de un período de fijación de 24-48 h.Riñónlos tejidos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se examinaron bajo un microscopio óptico. Los exámenes histopatológicos se realizaron con aumentos de 10x, 20x y 40x, en particular para evaluar la congestión vascular tanto en la médula como en los glomérulos corticales, la intensidad de la infiltración de células mononucleares y los tamaños y formas de las luces tubulares.

2.6. Análisis inmunohistoquímicos

El factor de transcripción nuclear-kB (NF-kB) y la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (p38-MAPK) son las dos principales vías de señalización a nivel de proteína en la biosíntesis de citoquinas proinflamatorias [19]. Además, el oxalato activa selectivamente la vía de señalización p38-MAPK [20]. Los portaobjetos se llevaron al recipiente de incubación después del bloqueo. El anticuerpo NF-kB/p65 (Santa Cruz, sc-109) se agregó a la primera sección, el anticuerpo MAPK/p38 (Santa Cruz, sc-7149) a la segunda sección y un anticuerpo secundario ( Se añadió antipolivalente de cabra, Thermo) a las secciones posteriores con fines de control y se mantuvo a más de 4 grados durante la noche. El ABCStaining Kit (Santa Cruz, sc-2018) se utilizó para el resto del protocolo de tinción. El tejido cubierto con láminas utilizando Entella se almacenó y se secó para examinarlo con un microscopio óptico. Las secciones se clasificaron de la siguiente manera, dependiendo de la intensidad de la tinción en el microscopio óptico, como en el estudio de Liu HS et al. [19]: (一) puntuación (puntuación negativa)∶ sin tinción;

puntuación (más) (1 puntuación positiva): leve;

(más más) puntuación (2 puntuaciones positivas): moderado;

Puntuación (más más más) (3 puntuaciones positivas): hay tinción completa.

2.7.Estadísticas

El análisis estadístico se realizó con el software Statistical Package for Social Sciences 11.0 (SPSS 11.0). Los valores se dieron como medias ± desviaciones estándar. La distribución normal de las variables se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov para una sola muestra. Se realizó un ANOVA de una vía y, si se demostró que era significativo, se utilizó la prueba post hoc de Duncan para evaluar y determinar las diferencias entre los grupos. El valor de p se consideró significativo cuando estaba por debajo de<>

3. Resultados

3.1. Resultados bioquímicos

Los datos del grupo de estudio se muestran en la Tabla 1. El nivel medio de MDA del grupo EG fue más alto que el del grupo de control, mientras que el nivel medio de MDA del grupo de quercetina fue significativamente más bajo que el del grupo EG (p= 0.001) . No hubo diferencia estadísticamente significativa entre los grupos en términos de actividad CAT. En nuestro estudio, los niveles de MDA se redujeron con la quercetina, mientras que la actividad de CAT no se vio afectada por la quercetina. Los niveles de oxalato urinario fueron significativamente más altos en el grupo EG que en los otros grupos (p<0.001). however,="" the="" urinary="" oxalate="" levels="" of="" the="" quercetin="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" the="" eg="" group=""><0.001). these="" results="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" the="" urinary="" oxalate="" levels,="" which="" were="" increased="" by="" eg="" administration.="" while="" the="" plasma="" urea="" concentration="" increased="" significantly="" in="" the="" eg="" group="" compared="" to="" in="" the="" control="" group,="" a="" statistically="" significant="" decrease="" was="" observed="" in="" the="" quercetin="" group="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><0.05). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" groups="" in="" terms="" of="" creatinine="" clearance="" and="" plasma="" oxalate="" levels="" (p="">0.05). Aunque la quercetina disminuyó el nivel de oxalato en plasma, esto no fue estadísticamente significativo. La concentración de calcio urinario fue significativamente menor en los otros grupos que en el grupo control (p<0.05). however,="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" eg="" and="" quercetin="" groups="" in="" terms="" of="" mean="" urinary="" calcium="" concentrations.="" altogether="" these="" findings="" indicate="" that="" eg="" increased="" urinary="" oxalate="" excretion="" and="" plasma="" urea="" concentration="" and="" decreased="" urinary="" calcium="">

3.2. Resultados histopatológicos

Los exámenes histopatológicos de los riñones de rata del grupo de control bajo el microscopio óptico revelaron resultados normales (Figura 1-Control). En el grupo EG se detectaron hallazgos, incluida la congestión en los vasos glomerulares, la infiltración de células mononucleares y el estrechamiento de las luces tubulares, especialmente en los túbulos proximales (Figura 1-EG). Se observaron hallazgos histopatológicos similares en el grupo de quercetina, pero todos fueron más leves (Figura 1-EG más quercetina). Sin embargo, no se utilizó ningún sistema de puntuación para evaluar si esta diferencia era estadísticamente significativa.

3.3. Resultados inmunohistoquímicos

El impacto de la quercetina en la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (p38-MAPK) y el factor nuclear kappa B (NF-kB) se investigó mediante tinción inmunohistoquímica de los tejidos renales (Figura 2). La comparación de los grupos en términos de p38-MAPK aclaró que los tejidos renales de las ratas del grupo EG se tiñeron significativamente más intensamente que los de las ratas del grupo control (p<0.001). on="" the="" other="" hand,="" p38-mapkstaining="" was="" significantly="" less="" intense="" in="" the="" quercetin="" group="" than="" in="" the="" eg="" group.="" the="" statistical="" analysis="" revealed="" that="" quercetin="" reduced="" p38-mapk="" activity="" significantly="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><>

Una comparación de los grupos con respecto a la inmunotinción de NF-kB reveló que los tejidos renales de las ratas en el grupo EG se tiñeron significativamente más intensamente que los de las ratas en el grupo de control (p<0.001). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" other="" groups="" in="" terms="" of="" the="" intensity="" of="" nf-kb="" staining.="" altogether,="" these="" findings="" pointed="" out="" that="" eginduced="" the="" p38-mapk="" and="" nf-kb="" activities="" in="" renal="" tissues.="" additionally,="" quercetin="" significantly="" reduced="" p38-mapk="" activity="" while="" it="" had="" no="" significant="" effect="" on="" nf-kb="" activity.="" the="" relevant="" data="" are="" displayed="" in="" table="">

4. Discusión

A pesar de los avances en los métodos mínimamente invasivos para el tratamiento de la nefrolitiasis, las altas tasas de recurrencia y cálculos residuales aún constituyen problemas graves para los pacientes y los urólogos [21]. Por lo tanto, se necesitan estrategias de tratamiento médico eficaces.

No se han identificado los mecanismos exactos de formación de cálculos; sin embargo, se sabe que aproximadamente el 80 por ciento de los cálculos renales contienen CaOx y una de las causas más comunes de los cálculos de CaOx es la hiperoxaluria [1,22]. El oxalato es un subproducto del metabolismo normal, eliminado del cuerpo en condiciones normales [20]. En hiperoxaluria. el exceso de oxalato urinario se combina con el calcio a pH fisiológico y forma cristales de CaOx, que se acumulan en los riñones. Se demostró que los cristales de CaOx dañan las células epiteliales de los túbulos renales y provocan cálculos renales [14,20]. Por lo tanto, los modelos de ratas con hiperoxaluria se utilizaron ampliamente para imitar la formación de cálculos renales en humanos. En estos estudios, se utilizó EG como agente inductor de hiperoxaluria, como fue el caso en nuestro estudio [14,20].

Se informó que la concentración de oxalato en la orina aumentó en dos días, se desarrolló hiperoxaluria en tres días, se desarrolló cristaluria de CaOx en dos semanas y se observó nefrolitiasis de CaOx en {{0}} semanas cuando 0.{{2} Se administró } por ciento de EG para inducir hiperoxaluria [14,22]. Al final de este proceso, otros factores urinarios y el aclaramiento de creatinina permanecieron dentro de los límites normales, mientras que el pH urinario y la excreción de citrato se redujeron significativamente [14,22]. En nuestro estudio, inducimos hiperoxaluria mediante la administración de EG al 1 por ciento, lo que posteriormente provocó daño celular en las células tubulares.

En la hiperoxaluria, la acumulación de cristales de CaOx en la luz del conducto colector de la papila renal y los depósitos similares a cálculos resultantes conducen a la obstrucción, lo que allana el camino para el deterioro renal. Como resultado de este proceso, los niveles sanguíneos de productos de desecho nitrogenados, como el ácido úrico, el nitrógeno ureico en sangre y la creatinina, pueden aumentar [22,23]. En nuestro estudio, la disfunción renal se demostró por un marcado aumento en los niveles de urea sérica en los animales tratados con EG. Sin embargo, el tratamiento con quercetina redujo significativamente los niveles de urea sérica.

La quercetina es una molécula con potentes efectos antioxidantes y antiinflamatorios [24]. Se encuentra en verduras, frutas, té y numerosos tipos de alimentos. Además de ser un fuerte eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), la quercetina aumenta la capacidad antioxidante total del plasma [25,26]. En algunos estudios se informó que los flavonoides reducen el estrés oxidativo en las células tubulares renales, previenen la acumulación de cristales de CaOx y reducen la peroxidación lipídica inducida por el oxalato en cultivos celulares [27,28].

Está ampliamente aceptado que el estrés oxidativo juega un papel importante en la formación de cálculos renales [12,22]. Los cristales de CaOx acumulados en el tejido renal conducen a la síntesis de varias macromoléculas que inician procesos inflamatorios y fibrogénicos. Las especies reactivas de oxígeno probablemente estén involucradas en varios eventos de señalización durante este período [14]. En estudios de cultivo de células epiteliales tanto en animales como en riñones, se demostró la formación de radicales libres en respuesta a la hiperoxaluria y la formación de cristales de CaOx [20,22]. Dado que los lípidos son las biomoléculas más sensibles de la membrana celular frente a los radicales libres, la peroxidación lipídica se produce en las membranas celulares [27,28]. La peroxidación de lípidos es el evento principal de daño celular, ya que altera la estructura de la membrana y posteriormente causa daño celular. La MDA es un indicador de peroxidación lipídica; también indica que las ROS están sobreproducidas [22,29]. Por lo tanto, se utiliza en la evaluación de la peroxidación lipídica. Se sabe que el daño causado por la deposición de CaOxcrystal y la formación de ROS puede prevenirse o reducirse con antioxidantes endógenos como la superóxido dismutasa (SOD), CAT y la glutatión peroxidasa (GSH-Px) [20,22,29]. En el presente estudio, se encontró que los niveles de MDA aumentaron en un modelo animal experimental de nefrolitiasis hiperoxalúrica, que se creó con éxito mediante la administración de etilenglicol. Nuestro estudio también mostró que la quercetina redujo el efecto potenciador del estrés oxidativo de la hiperoxaluria, como lo demuestran los parámetros bioquímicos e histopatológicos.

Se sabe que las ROS activan moléculas de señal como la proteína quinasa C (PKC), la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y la p38-MAPK [21]. La activación de estas moléculas de señal conduce a la inducción de NF-kB y factores de transcripción de proteína activa-1(AP-1). Como resultado de estos eventos, la expresión de proteínas como la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), la osteopontina (OPN), la fibronectina y el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF{{11} })aumentar [20]. Estas proteínas facilitan la adhesión de los cristales de CaOx y los procesos inflamatorios relevantes [20]. Peerapen et al. informaron que las vías de señalización de p38-MAPK mediaban la interrupción de las estrechas conexiones entre las células epiteliales [30]. También demostraron que la expresión de las proteínas implicadas en la vía de señalización de p38-MAPK aumentaba durante la formación de cálculos de oxalato de calcio. También se demostró que el oxalato activaba selectivamente la vía de señalización p38-MAPK, que tenía un papel esencial en la nefrotoxicidad del oxalato en las células epiteliales del riñón humano [31]. Shiyong Qi et al. demostró que los cristales de CaOx inducían la mejora de las moléculas de adhesión en las células epiteliales tubulares proximales, y este proceso estaba mediado por la vía de señalización p38-MAPK [31]. Nuestro estudio mostró que el oxalato inducía la activación de p38-MAPK y NF-kB. Además, mostramos que la quercetina redujo significativamente la actividad de p38-MAPK. Con base en esta información, se puede sugerir que la quercetina puede prevenir la recurrencia de los cálculos de CaOx.

El estudio tiene algunas limitaciones. La primera es que no hubo un grupo de control al que se le administró quercetina sola. Por lo tanto, el efecto de la quercetina administrada por vía oral sobre la producción y absorción intestinal de oxalato no se ha evaluado claramente. En segundo lugar, tampoco se evaluó el efecto de la quercetina sobre la absorción de etilenglicol. En consecuencia, se necesita más investigación para aclarar el mecanismo de acción de la quercetina sobre la hiperoxaluria.

5. Conclusiones

Concluimos que la quercetina inhibe los procesos inflamatorios y oxidativos desencadenados por la hiperoxaluria en los tejidos renales. Dado que estos procesos conducen a la formación de cálculos de CaOx, se puede considerar la quercetina en el tratamiento médico preventivo de los cálculos de CaOx recurrentes. Sin embargo, se necesita más investigación experimental y clínica para validar nuestros hallazgos.

Referencias

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