Los análisis de proteómica y citocinas distinguen los casos de encefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica de los controles, parte 2

Las correlaciones de los niveles de proteína con los metadatos clínicos indican su importancia en el estado de la enfermedad

Todas las proteínas se analizaron en busca de correlaciones con los metadatos clínicos utilizando los mismos métodos descritos anteriormente. Sólo resultados significativos después del ajuste para comparaciones múltiples (q<0.1) are shown in Table 2. There were significant correlations between plasma cytokines, plasma proteomics, and the clinical metadata, but none were found with the EV cytokine dataset (Table 2).

Cistanche puede actuar como antifatiga y potenciador de la resistencia, y estudios experimentales han demostrado que la decocción de Cistanche tubulosa podría proteger eficazmente los hepatocitos hepáticos y las células endoteliales dañadas en ratones nadadores que soportan peso, regular positivamente la expresión de NOS3 y promover el glucógeno hepático. síntesis, ejerciendo así eficacia antifatiga. El extracto de Cistanche tubulosa rico en glucósidos feniletanoides podría reducir significativamente los niveles séricos de creatina quinasa, lactato deshidrogenasa y lactato, y aumentar los niveles de hemoglobina (HB) y glucosa en ratones ICR, y esto podría desempeñar un papel antifatiga al disminuir el daño muscular. y retrasar el enriquecimiento de ácido láctico para el almacenamiento de energía en ratones. Las tabletas compuestas de Cistanche Tubulosa prolongaron significativamente el tiempo de natación con carga de peso, aumentaron la reserva de glucógeno hepático y disminuyeron el nivel de urea sérica después del ejercicio en ratones, mostrando su efecto antifatiga. La decocción de Cistanchis puede mejorar la resistencia y acelerar la eliminación de la fatiga en ratones que hacen ejercicio, y también puede reducir la elevación de la creatina quinasa sérica después del ejercicio de carga y mantener normal la ultraestructura del músculo esquelético de los ratones después del ejercicio, lo que indica que tiene los efectos. de potenciación de la fuerza física y antifatiga. Cistanchis también prolongó significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones envenenados con nitritos y mejoró la tolerancia contra la hipoxia y la fatiga.

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Dentro del conjunto de datos de citocinas plasmáticas, tanto el factor estimulante de colonias 2 (CSF2) como la leptina se correlacionaron negativamente con el sexo y se correlacionaron positivamente con el IMC tanto en el grupo EM/SFC como en el grupo control (Fig. 6a). Curiosamente, las personas con EM/SFC y SII tienen concentraciones más altas de LCR2 y leptina que las personas con EM/SFC y sin SII, y estas correlaciones no se observaron en el grupo de control (Fig. 6b).

La cohorte EM/SFC también reveló correlaciones significativas únicas con los datos del cuestionario de salud relacionados con la función física (SF{{0}}) y la fatiga (MFI-20) que no se encontraron en el grupo de control. CSF2 y leptina se correlacionaron negativamente con la función física (r=− {{10}}.539, q=0.002 para CSF2; r{{9 }}− 0,558, q=0.002 para leptina) y el resumen de componentes físicos (r=− 0,459, q=0.035 para CSF2; r=− 0,445 , q=0.035 para leptina), y correlacionado positivamente con la fatiga general (r=0.439, q=0.047 para CSF2; r=0.436, q =0.047 para leptina) (Tabla 2, Fig. 6c).

Encontramos otras correlaciones significativas entre las citocinas y los datos clínicos en sujetos con EM/SFC que no se encontraron en los controles: CCL2, CXCL1{{30}} y CCL11 se correlacionaron positivamente con la edad (r{{3} }.440, q=0.060 para CCL2; r=0.394, q=0.099 para CXCL10; r=0.431, q=0 .060 para CCL2) (Fig. 6d). Ambos (TNF e IL1RA se correlacionaron positivamente con el IMC (r=0.543, q=0.001 y r=0.468, q=0.010 respectivamente), y correlacionado negativamente con la categoría Función Física del SF-36 (r=− 0.508, q=0.004 y r=− 0.480, q=0. 007 para TNF e IL1RA respectivamente) (Fig. 6e). Por último, IL13 se correlacionó positivamente con la puntuación de Actividad Reducida del cuestionario MFI- 20 (r=0.482, q=0.025 ).

Como se mencionó anteriormente, se encontraron correlaciones significativas adicionales entre el conjunto de datos de proteómica plasmática y los metadatos clínicos. Hubo 9 correlaciones significativas en el grupo de control y sólo dos en los sujetos con EM/SFC (Tabla 2, parte inferior). En las muestras de control, la proteína S (PROS1) y el receptor tipo Fc 3 (FCRL3) se correlacionaron negativamente con Vitalidad (r=− 0.590, q=0 .015 para PROS1, r=− 0.538, q=0.039 para FCRL3). Además, PROS1 se correlacionó negativamente con el resumen de componentes físicos SF-36 (r=− 0,608, q=0.008) y se correlacionó positivamente con la puntuación de fatiga general MFI-20 (r=0.590, q=0.016). La proteína de transferencia de éster de colesterol (CETP) se correlacionó positivamente con la fatiga general (r=0.547, q=0.032) y las puntuaciones totales del MFI-20 (r{{35} }.557, q=0.025), y la subunidad alfa 1 de hemoglobina (HBA1) se correlacionó negativamente con las dos mismas puntuaciones (r=− 0,558, q=0.046 y r=− 0,556, q=0.025 respectivamente) (Fig. 7a). En el grupo EM/SFC, el miembro 5 de la familia Serpin A (SERPINA5) se correlacionó positivamente con la salud general (r=0.646, q=0.004) y el funcionamiento social (r=0 .593, q=0.027) del cuestionario SF-36 (Fig. 7b).

Una regresión lineal sólida revela relaciones adicionales entre ciertas proteínas y la información clínica

Para comprender mejor la relación entre las proteínas y los metadatos, realizamos una regresión lineal sólida y pruebas t para los coeficientes estimados. Se realizó una regresión lineal sólida para las citocinas EV, las citocinas plasmáticas y la proteómica plasmática, respectivamente. Cada modelo incluía un nivel de proteína específico como variable predicha y la cohorte (EM/SFC o control), sexo, edad, IMC y síndrome del intestino irritable (SII) como covariable. También se incluyeron en el modelo las interacciones entre la cohorte y las covariables de metadatos. Las interacciones prueban la hipótesis de que la relación entre los metadatos y el nivel de una proteína es diferente en EM/SFC que en el grupo de control. Los efectos significativos se resumen en la Tabla 3. Es una práctica estándar en bioestadística incluir ambos efectos principales siempre que dos variables tengan una interacción estadísticamente significativa. El razonamiento aquí es que la interacción muestra que las variables están teniendo efectos incluso si el efecto principal no alcanza significación estadística. Seguimos esta práctica. En la Tabla 3, Hombre es una variable ficticia (indicadora o 0–1) que equivale a 1 para hombres y 0 para mujeres. De manera similar, EM/SFC es una variable ficticia que es 1 o 0 para casos o controles, respectivamente, y SII es una variable ficticia igual a 1 o {{10}} para sujetos con o sin SII, respectivamente. EM/SFC: La edad es el producto de EM/SFC y la edad, por lo que es igual a 1 para los casos de EM/SFC e igual a 0 para los controles. EM/SFC: Hombre es el producto de dos variables ficticias y, por lo tanto, es igual a 1 para los hombres en el grupo EM/SFC e igual a 0 para todos los demás sujetos. EM/SFC:(+) SII es igual a 1 para casos de EM/SFC con SII y 0 en caso contrario.

En las muestras de citocinas EV, la edad fue significativa para predecir el nivel de CXCL1 (=− 0.013, q=0.035) y el nivel de CCL11 (=0.032, q{ {9}}.035). Así, CXCL1 disminuye con la edad pero CCL11 aumenta con la edad. (Tabla 3).

En las citoquinas plasmáticas, tanto el IMC como los hombres predijeron significativamente los niveles de leptina y CSF2. El efecto de la variable ficticia Hombre es la diferencia entre las medias de hombres y mujeres. Por ejemplo, la media de la variable leptina (o CSF2) es, en igualdad de condiciones, 1,119 (o 1,230) menor para los hombres en comparación con las mujeres. Tanto para CCL2 como para CSF3, el efecto principal de la edad y el término de interacción entre la edad y la cohorte fueron significativos. Las intersecciones para la regresión de CCL2 sobre la edad son 0.690 y 0.690− 2.696= − 2.{{27} }06 para controles y casos, respectivamente. Por cada aumento de un año en la edad, el promedio de CCL2 disminuirá en 0.037 en los controles y aumentará en 0.075–0.037=0.038 en casos. Las intersecciones para la regresión de CSF3 en función de la edad son 0,576 y 0,576−1.994=− 1,418 para controles y casos, respectivamente. Por cada aumento de un año en la edad, el promedio de SFC3 disminuirá en 0,047 en los controles y aumentará entre 0,075 y 0,047=0.028 en los casos.

En los datos de proteómica plasmática, la edad también fue significativa para predecir el nivel de SAA1 (=0.047, q=0.049). Para PFN1, la interacción entre EM/SFC y el sexo fue significativa ( =− 1,901, q=0.03{{20} }). La media de PFN1 es 0.809 para controles femeninos, 0.809−0.996=− 0,187 para casos femeninos, 0.809+0 .081=0.890 para controles masculinos y 0.809+0.081−0.996−1.901=− 2.007 para casos masculinos. Por lo tanto, la PFN1 media es mayor en los controles que en los casos de ambos sexos, pero la diferencia es mucho mayor en los hombres (0,809+0.187=0.996 para las mujeres frente a 0,890+2. 007=2.897 para hombres).

Para IGHA2, la interacción entre EM/SFC y SII fue significativa (=3.467, q < 0.001). La media de IGHA2 es 0.454 para controles sin SII, {{20}}.454−2.048=− 1,594 para casos de EM/SFC sin SII, {{33 }}.454−2.811=− 2.357 para controles con SII, y 0.45 4−2.048−2.811+3.{ {26}}− 0.938 para casos con SII. Por lo tanto, el IGHA2 medio es mayor en los controles que en los casos de sujetos sin SII, pero mayor en los casos que en los controles de sujetos con SII. Para LRG1, la interacción entre EM/SFC y SII fue significativa (=3.093, q < 0.001). La media de LRG1 es 0,261 para controles sin SII, 0,261-1.082=- 0,821 para casos de EM/SFC sin SII, 0,261-2.502=- 2,241 para controles con SII y 0,261-1,082 −2.502+3.093= 0.230 para casos con SII. Vemos que la LRG1 media es mayor en los controles que en los casos de sujetos sin SII, pero mayor en los casos que en los controles de sujetos con SII (Tabla 4).

El SII tiene efectos opuestos en casos y controles sobre IGHA2 y LRG1 (Tabla 4). Aunque estas diferencias son estadísticamente significativas, cabe señalar que sólo hubo un sujeto de control con SII.

Tres enfoques de aprendizaje automático dan como resultado modelos predictivos y discriminativos

Los 20 principales analitos de proteínas y los valores de importancia de las características para cada uno de los tres enfoques de aprendizaje automático se pueden encontrar en la Tabla 5. Los tres métodos tuvieron un rendimiento excelente para distinguir EM/SFC de los controles que utilizaron los 2{{ principales 16}} analitos proteicos con 250 replicaciones de validación cruzada quíntuple. La Figura 8 muestra las curvas ROC y los valores AUROC de estos tres clasificadores con las 20 proteínas principales clasificadas en mediciones de importancia. El clasificador XGBoost tuvo el mejor rendimiento con un alto grado de precisión (86.1%, archivo adicional 1: Fig. S3a) con un valor AUROC con validación cruzada de 0.947 (IC del 95% { {26}}.895–0.998). Además, utilizando las 8 proteínas principales de cada clasificador, la regresión logística (LASSO) dio los mejores resultados con un AUC de 0.873 (IC del 95 % 0.792–0,953) y una precisión del 78,6 %. (Fig. 8b y archivo adicional 1: Fig. S3b). Finalmente, Random Forest con 7 analitos de proteínas comunes a las tres listas de las 20 principales (proteínas en negrita en la Tabla 5) distinguió EM/SFC de los controles con un valor AUROC de 0,891 (IC del 95 %: 0,817–0,966) y una precisión del 79,1 % (Fig. .8c y archivo adicional 1: Fig. S3c).

Discusión

En este estudio, utilizamos muestras y datos de 98 de los 100 sujetos que previamente proporcionaron muestras que fueron analizadas para detectar metagenómica fecal y citocinas plasmáticas [26] y también para proteínas plasmáticas analizadas mediante espectrometría de masas [14]. Además, se aislaron vesículas extracelulares de estas 98 muestras y encontramos que el tamaño medio y las concentraciones de partículas eran significativamente mayores en EM/SFC (Fig. 2). Aunque un informe anterior que utilizó el mismo método de purificación de EV que el presente estudio encontró que el tamaño medio de los EV de EM/SFC se redujo [42], los autores analizaron los EV aislados de 10 pacientes con EM/SFC y 5 controles sanos frente a 49 EM/SFC. CFS y 49 controles en este estudio no usaron trombina para eliminar el fibrinógeno y usaron fuerzas centrífugas bajas para sedimentar los vehículos eléctricos (1500 g frente a 12,000 g en este estudio). En conjunto, esto podría explicar los diferentes resultados observados con nuestro estudio actual. Finalmente, nuestros resultados confirmaron otros hallazgos que informan concentraciones más altas de vesículas en EM/SFC [24, 25, 42] y estas observaciones también se observan en afecciones como la enfermedad de Alzheimer [17] y la enfermedad cerebrovascular [20].

Nuestro trabajo demuestra el valor de utilizar múltiples ensayos en las mismas muestras y también la importancia de realizar correlaciones con datos clínicos. Hacerlo nos ha permitido identificar varias asociaciones de proteínas particulares con los síntomas del paciente. Es importante destacar que demostramos que los datos pueden distinguir entre pacientes y controles con alta precisión. Durante mucho tiempo, algunos han considerado incorrectamente la EM/SFC como una enfermedad psicológica. Poder separar pacientes y controles mediante análisis de plasma es una fuerte demostración de la naturaleza biológica de la enfermedad. En la Fig. 9 se muestra un resumen de nuestros ensayos experimentales y hallazgos clave.

Nuestro análisis actual de 98 muestras concuerda con la comparación anterior de citoquinas plasmáticas en 100 EM/SFC y controles, que no identificaron diferencias significativas entre cohortes después del ajuste para pruebas múltiples [26]. Por el contrario, identificamos 17 citoquinas EV que distinguen a pacientes y controles con valores de p ajustados inferiores a 0,2, todos más altos en sujetos con EM/SFC. De estas 17 proteínas, se sabe que la mayoría (10 de 17) son citocinas/quimiocinas proinflamatorias (TNF, IL1, CXCL8, CXCL1, IL15, CCL7, IL17, CCL5, IL1 e IL1R1), 5 están relacionadas Para la inmunidad adaptativa (IL2, CSF2, IL3, IL4 e IL7), IL12p40 tiene propiedades antiinflamatorias y el NGF es proinflamatorio y antiinflamatorio. Los niveles más altos de citocinas proinflamatorias concuerdan con informes anteriores [43-45].

Aunque las diferencias en los niveles de citoquinas EV no alcanzaron significación estadística después de la corrección para comparaciones múltiples en un estudio piloto anterior con solo 38 sujetos, 13 de las 17 citocinas EV en el presente estudio también se encontraron en niveles más altos en EV de sujetos con EM/SFC en comparación con los controles [25]. La diferencia más significativa fue IL2 (q=0.007, Fig. 3). La IL2 es una citoquina secretada producida por los linfocitos T CD4+ y CD8+ activados y promueve una fuerte proliferación de células B activadas y, posteriormente, la producción de inmunoglobulinas. Desempeña un papel fundamental en la regulación del sistema inmunológico adaptativo al controlar la supervivencia y proliferación de las células T reguladoras. Se encontró que los niveles de IL2 eran más altos en el líquido cefalorraquídeo [46] y en el plasma de pacientes con EM/SFC [47]. Los niveles más altos de IL2 encontrados en los vehículos eléctricos en el presente estudio podrían ser parte de una respuesta inmune específica en EM/SFC. Varias citocinas/quimiocinas que se observó que estaban desreguladas son producidas por células B o también son reguladoras de células B (p. ej., CXCL1 y CXCL12).

Las correlaciones de citocinas con otras citocinas proporcionan información sobre las redes de interacciones entre moléculas de señalización. Varios otros estudios demostraron que las redes de citocinas plasmáticas o de vesículas extracelulares difieren entre los sujetos con EM/SFC y los controles [25, 41, 44, 48]. Hemos optado por mostrar correlaciones entre los tres tipos de datos: plasma y citoquinas EV y proteómica plasmática, utilizando correlogramas. La inspección de la representación visual de estas interacciones proteína-proteína revela inmediatamente que existen correlaciones positivas entre las citocinas EV y entre las citocinas plasmáticas que ocurren en los casos pero no en los controles y viceversa (Fig. 5). Una observación particularmente sorprendente es una mayor cantidad de correlaciones positivas entre las citocinas plasmáticas en EM/SFC que en los controles (Fig. 5b), lo que indica que la señalización de las citocinas es sustancialmente diferente, tal vez reflejando un entorno inflamatorio.

Setenta y una proteínas caracterizadas por espectrometría de masas mostraron correlaciones significativas con otras proteínas plasmáticas (Fig. 5c). Por ejemplo, F2 exhibió 31 correlaciones positivas con otras proteínas, de las cuales once se observaron en casos pero no en controles. F2 es el factor de coagulación II o trombina y convierte el fibrinógeno en fibrina y activa los factores V, VII, VIII y XIII. La trombina promueve la activación y agregación plaquetaria, pero también se cree que tiene otras funciones durante la inflamación y la cicatrización de heridas [49].

A pesar de no observar diferencias significativas en los niveles de citocinas plasmáticas entre las dos cohortes, sí observamos correlaciones de las citocinas plasmáticas con los datos clínicos. El CSF2, también conocido como factor de estimulación de colonias de monocitos granulocitos (GM-CSF), es más bajo en los hombres tanto en EM/SFC como en los controles y aumenta con el IMC en ambas cohortes de acuerdo con los análisis de correlación y regresión lineal robusta (Fig. 6a, Tablas). 2 y 3). En la cohorte EM/SFC, con un aumento del LCR2, las puntuaciones en las escalas de función física SF36 y fatiga MFI indican un mayor impacto de los síntomas físicos y de fatiga, respectivamente. Un aumento de GM-CSF se asocia con inflamación crónica [50]. GM-CSF induce a los monocitos clásicos a diferenciarse en células dendríticas y macrófagos derivados de monocitos in vitro [51]. Los monocitos clásicos exhiben un patrón de expresión genética único en EM/SFC en comparación con los controles [52], y un nivel elevado de GM-CSF podría ser un factor de señalización involucrado en esta respuesta.

Los aumentos en los niveles de tres citocinas, CCL2, CXCL10 y CCL11, se asociaron con un aumento de la edad sólo en la cohorte EM/SFC, según las correlaciones de Spearman. CCL2, también conocida como MCP-1 (Proteína quimioatrayente de monocitos-1), atrae monocitos a través del endotelio hacia los tejidos [53] y también podría ser un factor en el perfil de expresión génica de monocitos alterado [54]. También se observó que CCL2 disminuye con la edad en la cohorte total mediante regresión lineal robusta y correlación de Spearman, pero aumenta en la cohorte EM/SFC al aumentar la edad, según la correlación de Spearman (Fig. 6d, Tabla 3). Utilizando una regresión lineal robusta, el CCL11 en plasma no aumentó significativamente con la edad, pero se predijo que el CCL11 EV sería mayor con el aumento de la edad. CXCL10 (IP10) también participa en la migración celular, en particular, en la atracción de macrófagos, monocitos y células T y NK activadas [55]. Se sabe que CCL11, también conocida como eotaxina, aumenta con la edad y niveles más altos se asocian con una disminución de la neurogénesis [56]. Dos grandes estudios observaron previamente una asociación de leptina, GM-CSF, IP10 y eotaxina con la gravedad de EM/SFC [43] o una mayor eotaxina en casos de EM/SFC a largo plazo [41]. Casi todos los sujetos con EM/SFC en este estudio han estado enfermos durante más de 3 años.

Una mayor leptina se correlaciona con el sexo femenino y un mayor IMC tanto en pacientes como en controles mediante análisis robustos de regresión lineal y correlación (Tablas 2 y 3). Los niveles más altos de leptina también se asocian con el SII en la cohorte de pacientes (Fig. 6b). El aumento de leptina también se correlaciona con peores puntuaciones en las medidas de función física SF36 y en la escala de fatiga MFI (Fig. 6c). La leptina se correlacionó previamente con la fatiga y la gravedad en EM/SFC [43, 54]. Los niveles crecientes de otra citocina inflamatoria, TNF, también se correlacionan con puntuaciones más bajas de función física del paciente en el SF36 y previamente se ha informado que están elevados en EM/SFC [41, 57, 58] (Fig. 6e).

Los niveles más altos de IL1-RA, que antagoniza las citocinas inflamatorias IL1, se asociaron con un IMC más alto y una función física más baja SF-36 en los casos de EM/SFC (Fig. 6e). Aunque el IL1-RA podría considerarse antiinflamatorio, se sabe que los niveles de IL1-RA son más altos en la obesidad [59] y se considera que los niveles más altos son un marcador de desregulación metabólica [60]. , lo que podría estar resultando en una menor capacidad física.

Observamos que niveles más bajos de la citoquina antiinflamatoria IL13 se asociaron con una menor actividad en los casos de EM/SFC. Anteriormente se informó que la IL-13 era más baja en mujeres con EM/SFC que en los controles [61]. Por el contrario, una IL13 más alta se correlacionó con una mayor gravedad de los síntomas en un estudio [43], mientras que en otro no se observaron diferencias entre casos y controles [41].

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