La metabolómica de la orina expone una recuperación anómala después del esfuerzo máximo en pacientes femeninas con EM/SFC, Parte 3

¿Por qué estaremos cansados? ¿Cómo podemos solucionar los problemas de fatiga?

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3. Discusión

Esta es la primera vez que se caracteriza el metaboloma urinario de pacientes con EM/SFC antes y después de una prueba de ejercicio cuando los pacientes con EM/SFC experimentan PEM. Muchos de estos metabolitos nunca antes se habían medido en pacientes con EM/SFC, ya que estudios previos de metabolómica en orina en EM/SFC se han limitado a menos de 50 metabolitos y el estudio actual midió 1403. Además, el uso de controles sanos sedentarios para dar cuenta de Los niveles de actividad física, que pueden afectar los niveles de metabolitos iniciales y posteriores al ejercicio, son una ventaja clave del diseño del estudio actual que no se ha utilizado en estudios anteriores. Nuestros resultados mostraron aumentos generalizados en los niveles de metabolitos en la orina de los controles 24 h después del ejercicio que no se observaron en los pacientes con EM/SFC, y 110 de estos compuestos tuvieron una interacción significativa entre el estado de la enfermedad (EM/SFC o control ) y tiempo (línea de base versus post-ejercicio) (Figura complementaria S2). Además de numerosos análisis de los niveles de metabolitos en orina, la correlación de los niveles de metabolitos en orina y plasma arrojó evidencia adicional de desregulación metabólica en los pacientes con EM/SFC después del ejercicio. Este análisis proporcionó evidencia adicional de cambios fisiopatológicos en múltiples subvías, así como evidencia de diferencias en subvías adicionales que no tenían muchas diferencias significativas entre los pacientes con EM/SFC y los controles cuando se observaron los niveles de metabolitos en la orina de forma aislada.

Cistanche puede actuar como antifatiga y potenciador de la resistencia, y estudios experimentales han demostrado que la decocción de Cistanche tubulosa podría proteger eficazmente los hepatocitos hepáticos y las células endoteliales dañadas en ratones nadadores que soportan peso, regular positivamente la expresión de NOS3 y promover el glucógeno hepático. síntesis, ejerciendo así eficacia antifatiga. El extracto de Cistanche tubulosa rico en glucósidos feniletanoides podría reducir significativamente los niveles séricos de creatina quinasa, lactato deshidrogenasa y lactato, y aumentar los niveles de hemoglobina (HB) y glucosa en ratones ICR, y esto podría desempeñar un papel antifatiga al disminuir el daño muscular. y retrasar el enriquecimiento de ácido láctico para el almacenamiento de energía en ratones. Las tabletas compuestas de Cistanche Tubulosa prolongaron significativamente el tiempo de natación con carga de peso, aumentaron la reserva de glucógeno hepático y disminuyeron el nivel de urea sérica después del ejercicio en ratones, mostrando su efecto antifatiga. La decocción de Cistanchis puede mejorar la resistencia y acelerar la eliminación de la fatiga en ratones que hacen ejercicio, y también puede reducir la elevación de la creatina quinasa sérica después del ejercicio de carga y mantener normal la ultraestructura del músculo esquelético de los ratones después del ejercicio, lo que indica que tiene los efectos. de potenciación de la fuerza física y antifatiga. Cistanchis también prolongó significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones envenenados con nitritos y mejoró la tolerancia contra la hipoxia y la fatiga.

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3.1. Comparación con estudios previos de metabolómica urinaria en pacientes con EM/SFC

En general, nuestros resultados no son consistentes con los pocos estudios previos que miden los metabolitos en la orina en pacientes con EM/SFC en comparación con sujetos de control sin EM/SFC. Para comparar mejor nuestros resultados con estudios anteriores, que midieron menos metabolitos, comparamos los resultados al inicio del estudio para p < 0.05 en el LMM con los estudios anteriores. El único compuesto que resultó significativo en otro estudio y en el nuestro fue la alanina, aunque el estudio anterior encontró que la alanina era menor en pacientes mujeres que en los controles (valor p de ajuste de BH < 0.05) y en En nuestro estudio, la concentración media normalizada fue mayor en los pacientes con EM/SFC que en los controles [20]. Sin embargo, varios de los estudios encontraron diferencias al inicio del estudio en los compuestos que cambiaban de manera diferente en los pacientes con EM/SFC y en los controles durante la recuperación del ejercicio, incluida la fenilalanina (más baja en pacientes con EM/SFC [23,24]) y la valina (más baja en pacientes con EM/SFC). Pacientes con EM/SFC [20]). Tanto la fenilalanina como la valina también aumentaron significativamente en los controles sedentarios después del ejercicio en el estudio actual, por lo que es posible que los controles en otros estudios fueran más activos y ya tuvieran niveles más altos de fenilalanina en orina. Ningún otro estudio reclutó específicamente a sujetos sedentarios sin EM/SFC, aunque un estudio buscó igualar el "estilo de vida general" [23]. Armstrong y cols. examinó las correlaciones de Pearson entre los metabolitos en orina y plasma en pacientes con EM/SFC y controles al inicio del estudio, y encontró diferencias en acetato, lactato y fenilalanina con un umbral de |R| > 0,4 ​​en cualquiera de los grupos [20]. El acetato es demasiado pequeño para ser detectado en nuestro ensayo y no detectamos diferencias en las correlaciones en plasma y orina en lactato o fenilalanina.

McGregor y sus colegas también investigaron cambios en los metabolomas urinarios y plasmáticos en pacientes con EM/SFC que experimentan PEM [19]. Utilizaron una encuesta para separar a los pacientes con EM/SFC que actualmente experimentaban PEM en los últimos siete días y descubrieron que ocho de treinta metabolitos en la orina medidos tenían concentraciones significativamente más bajas en el grupo de EM/SFC en comparación con los controles. De estos, sólo la serina tuvo diferencias significativas en nuestros análisis; aumentó después del ejercicio en el grupo de control (Archivo de datos complementarios S2—Resultados LMM). Los niveles de dos metabolitos en la orina, acetato y metilhistidina, también fueron significativamente diferentes en el grupo con PEM y sin PEM [19]. Los niveles de metilhistidinas analizados en este estudio no fueron significativamente diferentes en el análisis LMM, pero sí encontramos diferencias en las correlaciones en plasma y orina de 1-metilhistidina y N-acetil-3-metilhistidina (Figura 9). McGregor y cols. También encontraron asociaciones de puntuaciones de PEM de siete días con varios metabolitos en plasma y orina [19].

3.2. El aumento posterior al ejercicio en los niveles de metabolitos urinarios en controles sedentarios es consistente con estudios anteriores

El metaboloma urinario en mujeres 24 h después del ejercicio no ha sido bien caracterizado. Hasta donde sabemos, ningún estudio ha medido el metaboloma urinario al inicio del estudio en comparación con 24 h después del ejercicio en mujeres. Un estudio midió 32 metabolitos en la orina antes del ejercicio y 24 h después del ejercicio en hombres, comparando a nueve ciclistas competitivos con ocho hombres sanos pero no entrenados de la misma edad (50 a 60 años) [48]. Si bien su estudio se centró en comparar a los atletas con los sujetos no entrenados, observaron cambios elevados después del ejercicio (más significativos que el doble) en los sujetos de control en los niveles de lactato, acetato e hipoxantina. El acetato no se midió en nuestro estudio, y ni el lactato ni la hipoxantina fueron diferentes desde el inicio hasta el post-ejercicio en nuestro grupo de control femenino. Mukherjee et al. encontró diferencias significativas entre los grupos de atletas y de control en ocho de los metabolitos medidos relacionados con una variedad de vías bioquímicas [48]. Por lo tanto, un punto fuerte del estudio actual es la selección de controles sanos sedentarios en comparación con individuos más activos, que pueden tener un metaboloma urinario alterado debido al ejercicio regular.

Si bien hay escasez de literatura publicada sobre el metaboloma de la orina 24 h después del ejercicio, hay varios estudios que miden los metabolitos de la orina tanto en hombres como en mujeres en momentos más tempranos después del ejercicio (revisado en [49]). Uno de los hallazgos que fue consistente entre los estudios es que la concentración de la mayoría de los lípidos aumenta en los biofluidos después del ejercicio, incluso en la orina. En particular, se ha demostrado que las concentraciones de acilcarnitina aumentan en sangre y orina en respuesta al ejercicio. Esto es consistente con los resultados de nuestro estudio en el que varios compuestos de acilcarnitina aumentaron significativamente después del ejercicio en la orina de los controles (Figura 7A).

El estudio más grande que incluyó mujeres (255 sujetos en total, 107 mujeres) también encontró cambios metabólicos extensos en la orina después del ejercicio, con 37 de 47 metabolitos medidos significativamente alterados después de la corrección FDR, y 33 de ellos aumentaron después del ejercicio [50]. . Esto es consistente con nuestro hallazgo de cambios metabólicos a gran escala después del ejercicio en la orina de los sujetos de control, y se encontró que la mayoría de los compuestos que fueron alterados tenían concentraciones aumentadas. Este estudio también completó un análisis comparativo estratificado por sexo, pero solo encontró dos metabolitos con proporciones post-ejercicio/valor inicial significativamente diferentes en mujeres y hombres.

En Schranner et al. En esta revisión, los hallazgos para los aminoácidos no son tan consistentes como los de los lípidos, que generalmente aumentan después del ejercicio [49]. Sin embargo, algunos hallazgos en la orina fueron consistentes en al menos dos estudios (aunque se combinan todos los momentos posteriores al ejercicio), incluido que los siguientes compuestos aumentaron en la orina después del ejercicio: alanina, O-acetil-homoserina, 5- hidroxiindolpiruvato, xanturenato, L-metanefrina, N-acetilvanilalanina y N-(carboxietil)arginina. Se encontró que los siguientes compuestos disminuyeron en la orina después del ejercicio en al menos dos estudios: glicina, histidina y n-óxido de trimetilamina. Comparando estos resultados con nuestro estudio, la mayoría de los metabolitos no fueron significativamente diferentes antes y después del ejercicio, o no se midieron en nuestro estudio. Sin embargo, también encontramos un aumento significativo en los niveles de alanina en los controles, lo que concuerda con los estudios revisados. En nuestro estudio, los niveles de glicina también aumentaron después del ejercicio en los controles en lugar de disminuir. Sin embargo, Kistner et al. Un estudio, que incluyó a muchas mujeres, también encontró que los niveles de glicina aumentaban significativamente después del ejercicio [50].

3.3. Diferencias entre controles sedentarios y pacientes con EM/SFC en la supervía de lípidos

Muchas subvías de lípidos fueron significativamente diferentes en la orina de los pacientes y los controles en este estudio, incluido el metabolismo de los ácidos grasos de acilcarnitina. Los metabolitos de acil carnitina aumentaron después del ejercicio en la orina en controles sanos y los cambios inducidos por el ejercicio fueron significativamente diferentes entre los controles y los pacientes con EM/SFC (Figuras 3, 7 y S4). Además, aunque no es una acil carnitina, la desoxicarnitina en la subvía lipídica del metabolismo de la carnitina se correlacionó de manera diferente entre el plasma y la orina en los pacientes con EM/SFC en comparación con los controles (Figura 9). Las acilcarnitinas son muy importantes en el metabolismo energético, ya que son necesarias para transportar ácidos grasos a las mitocondrias para su oxidación. La oxidación de ácidos grasos de cadena larga es el principal modo de metabolismo energético durante el ejercicio aeróbico. La alteración del metabolismo de la acilcarnitina durante el ejercicio podría estar contribuyendo a la intolerancia al ejercicio y a la PEM en pacientes con EM/SFC. En otro estudio que analizó solo a sujetos al inicio del estudio y que no reclutó específicamente controles sedentarios, se encontró que la subvía de acilcarnitina era significativamente diferente en pacientes con EM/SFC versus controles, y se encontró que cinco de ocho compuestos tenían una concentración más baja en los pacientes. [11]. Cuando solo se analizaron los sujetos de referencia, las mediciones específicas de acilcarnitina en suero indicaron que el compuesto era más bajo en pacientes con EM/SFC que en los controles en un informe [51] pero no se observaron diferencias en los niveles de orina o plasma en otro estudio [52]. En el plasma de la cohorte más grande de la cual los sujetos del presente estudio son un subconjunto, el grupo químico de carnitina también se alteró significativamente en los controles femeninos sedentarios durante la recuperación (definida como la diferencia entre 24 h post-ejercicio y 15 min post-ejercicio). ) y la mayoría de los compuestos aumentan después del ejercicio [25]. No se encontró que el grupo químico de carnitina estuviera significativamente alterado durante la recuperación del ejercicio en pacientes con EM/SFC. Si bien este grupo incluye más que solo acilcarnitinas, las acilcarnitinas son miembros y también contribuyen a su importancia en el análisis de enriquecimiento por similitud química en el estudio actual (Figura complementaria S4). También se ha demostrado ex vivo que la palmitoilcarnitina, que aumenta transitoriamente en el músculo después del ejercicio, puede actuar como una señal de esfuerzo del músculo a un subconjunto de neuronas [53].

Los metabolitos de los ácidos grasos de acilglicina son los únicos compuestos que se encontraron en la orina en concentraciones significativamente diferentes en EM/SFC frente a los controles en un solo momento (24 h después del ejercicio) y un compuesto de acilglicina diferente, 3-hidroxibutiroilglicina. , tuvo una correlación negativa significativa en los pacientes con EM/SFC al correlacionar U3/U1 con P3/P1 (Figuras 5 y 9). Además, la cis-3,4-metilenheptanoilglicina estaba cambiando de manera diferente durante la recuperación del ejercicio en los pacientes con EM/SFC frente a los controles (LMM, Figura complementaria S2). Si bien el metabolismo de la acilglicina no es una de las subvías que aumentó significativamente después del ejercicio solo en los controles, fue significativamente diferente en los pacientes con EM/SFC versus los controles tanto en el momento de 24 h después del ejercicio como cuando se analizó la diferencia. en las proporciones post-ejercicio/línea base (Figura 3). La excreción urinaria de determinadas acilglicinas también se ve alterada por trastornos relacionados con la oxidación de ácidos grasos en las mitocondrias, incluida la deficiencia de acilcoenzima A (CoA) deshidrogenasa (MCAD) de cadena media [54]. Nuestro grupo ha observado que la oxidación de ácidos grasos difiere en las células inmunes de los pacientes con EM/SFC frente a los controles [55].

3.4. Diferencias entre controles sedentarios y pacientes con EM/SFC en la supervía de aminoácidos

También encontramos muchas diferencias en los aminoácidos de la orina en los pacientes con EM/SFC y en los controles después del ejercicio. Dos de esas vías se destacaron porque tuvieron alteraciones significativas en los pacientes con EM/SFC versus los controles en todos nuestros análisis, incluido el análisis de la vía KEGG, y se analizan más adelante.

El ciclo de la urea en el hígado es una parte importante del metabolismo del ejercicio porque es necesario para eliminar los altos niveles de amoníaco que se producen durante el ejercicio [56,57]. Germain y sus colegas también encontraron que el ciclo de la urea y las vías de reciclaje de amoníaco SMPDB estaban significativamente alteradas en el plasma entre pacientes mujeres con EM/SFC y controles en un análisis de vías al comparar la diferencia entre los niveles de metabolitos a las 24 h post-CPET (P3) y 15 min post-CPET (P2) [25]. La acumulación de amoníaco se ha relacionado previamente con la neurotoxicidad y la fatiga inducida por el ejercicio [56,57]. La desregulación del ciclo de la urea en la orina y los metabolomas plasmáticos después del ejercicio en pacientes con EM/SFC puede estar causando la acumulación de amoníaco, pero los 1403 compuestos medidos por Metabolon® en la orina no incluyeron amoníaco porque es un compuesto volátil y también más pequeño que el límite de detección de la plataforma Metabolon®.

La cisteína, la metionina, la SAM y la taurina son aminoácidos importantes ya que son los únicos que contienen azufre, y la cisteína es única en su capacidad para formar enlaces disulfuro. La cisteína también se puede convertir en glutatión y taurina. La cisteína y la metionina desempeñan numerosas funciones en el metabolismo celular, pero también son componentes clave de las proteínas [37]. Debido a su grupo tiol, la cisteína participa en la catalización de muchas reacciones enzimáticas y en el mantenimiento de la homeostasis redox. Los cambios en el metabolismo de la cisteína ocurren en muchos trastornos neurodegenerativos, incluidas la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson [58]. Si bien el metabolismo de la cisteína, la metionina, la SAM y la taurina mostró muchas diferencias entre los pacientes y los controles en nuestros análisis del metaboloma en orina, las correlaciones en orina y plasma revelaron compuestos adicionales con diferencias significativas entre los pacientes con EM/SFC y los controles, incluida la cisteína, que es se produce cuando dos cisteínas se oxidan para formar un enlace disulfuro, y la cistationina, que es un intermediario en la producción de cisteína en el ciclo de la metionina [37].

3.5. Limitaciones

Nuestro estudio tiene varias limitaciones importantes. En primer lugar, la dieta de los sujetos no estaba controlada y la ingesta dietética de metabolitos puede afectar su excreción en la orina. En segundo lugar, reconocemos que la falta de coincidencia del IMC no es ideal y es una limitación de este estudio. Nuestra cohorte más grande de pacientes con EM/SFC y controles sedentarios sanos tiene un IMC equivalente y, por lo tanto, si se amplía este estudio piloto, esto no será un problema en el futuro. En tercer lugar, nuestros resultados se limitan a pacientes femeninas con EM/SFC. Si bien es muy importante estudiar ambos sexos en EM/SFC y se está descubriendo un número cada vez mayor de diferencias sexuales en la fisiopatología [25,59,60], decidimos centrar nuestro estudio piloto en mujeres debido a la mayor carga de enfermedad de la EM. /SFC en mujeres (60–65% mujeres) [2]. Además, debido a que capturamos el metaboloma de la orina solo en dos momentos, al inicio y 24 h después del ejercicio, no podemos decir si los pacientes con EM/SFC han alterado los niveles de excreción de algunos de estos metabolitos en un momento anterior o posterior. punto que los controles. Estos aumentos en los productos de excreción pueden estar ocurriendo en los pacientes, pero con un retraso mayor, similar a cómo los pacientes con EM/SFC muestran un retraso general en la recuperación del ejercicio. Sin embargo, también es posible que esta falta de excreción metabólica alterada sea parte de una falta general de una respuesta metabólica saludable al ejercicio.

4. Materiales y métodos

4.1. Temas de estudio

En este estudio se incluyeron ocho controles sedentarios sanos y diez pacientes con EM/SFC. Los pacientes con EM/SFC fueron diagnosticados según los Criterios del Consenso Canadiense [3]. Los 18 sujetos incluidos en este estudio formaron parte de una cohorte más grande de 173 participantes en total (Identificador de ClinicalTrials.gov: NCT04026425) [61]. Para este estudio piloto, todos los sujetos incluidos fueron mujeres. Los sujetos fueron reclutados con los siguientes criterios. Todos los participantes deben tener entre 18 y 70 años. Los sujetos fueron excluidos de cualquiera de los grupos si eran fumadores, estaban embarazadas o amamantando, eran diabéticos, consumían cantidades excesivas de alcohol o tenían una limitación ortopédica que les impedía realizar la CPET. Los diagnósticos de esquizofrenia, trastorno depresivo mayor, trastorno bipolar o trastorno de ansiedad también fueron criterios de exclusión en ambos grupos. Además, se excluyeron los controles sedentarios sanos si se les diagnosticaba algún trastorno autoinmune. La función renal fue normal en todos los sujetos de este estudio, según lo evaluado por los siguientes análisis de sangre de laboratorio estándar de Quest Diagnostics: creatinina sérica, nitrógeno ureico en sangre y tasa de filtración glomerular estimada (eGFR).

Diecisiete sujetos realizaron la prueba de ejercicio en Ithaca College en Ithaca, Nueva York, y un sujeto realizó la prueba de ejercicio en ID Med en Torrance, California. Se pidió a todos los participantes que dejaran de tomar suplementos nutricionales, incluidos los probióticos, durante dos semanas antes de la prueba de ejercicio. Se pidió a los participantes que suspendieran los analgésicos y los medicamentos estimulantes durante dos días antes de la prueba de ejercicio. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito y todos los protocolos fueron aprobados por el IRB #1017-12Dx2 de Ithaca College. Todos los participantes completaron la Escala de discapacidad de Bell [26], la encuesta de salud de formato breve-36 [62] y cuestionarios personalizados. Los pacientes con EM/SFC completaron además el inventario de fatiga multidimensional [63].

4.2. Prueba de ejercicio cardiopulmonar y recolección de muestras de orina

El CPET se realizó en una bicicleta ergómetro estacionaria, con el siguiente protocolo: 3 min de descanso seguido de ciclismo continuo en el que la carga de trabajo incremental aumenta 15 vatios por minuto de ejercicio hasta el agotamiento voluntario (aprox. 8-10 min). Se midió el índice de intercambio respiratorio (RER), que es la tasa de producción de dióxido de carbono dividida por la tasa de consumo de oxígeno, para garantizar que los participantes realizaran la prueba con suficiente esfuerzo (RER > 1,1 indica esfuerzo máximo).

Todas las muestras de orina se recogieron por la mañana: (1) 15 a 20 minutos antes del CPET y (2) 24 h después. La orina se recogió a mitad del chorro en recolectores de orina estériles, se dividieron en alícuotas, se centrifugaron a 10,{7}} × g durante 10 minutos para eliminar los restos celulares y se almacenaron a -80 ◦C. Las muestras de orina se sometieron a un ciclo de congelación/descongelación para realizar más alícuotas y las alícuotas se enviaron durante la noche a Metabolon® en hielo seco.

4.3. Ensayo de metabolómica

Los metabolitos se midieron utilizando la plataforma de metabolómica global de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) Precision Metabolomics™ en Metabolon®. Los métodos detallados se han descrito anteriormente [64]. Brevemente, las muestras se extrajeron en metanol (5:1 metanol:muestra) y luego se evaporaron. Los metabolitos se detectaron en cada muestra utilizando cuatro plataformas LC-MS/MS diferentes que se optimizaron para compuestos hidrófilos e hidrófobos y utilizaron ionización positiva y negativa. Toda la cromatografía utilizó una LC de rendimiento ultraalto (UP) Waters Acquity y un volumen de inyección de 5 µl (con muestras reconstituidas en disolventes apropiados para cada plataforma). Toda la espectrometría de masas se realizó con espectrómetros de masas de alta resolución y precisión ThermoScientific Q-Exactive con fuentes de ionización por electropulverización calentadas (HESI-II) y analizadores de masas Orbitrap operados a una resolución de masas de 35,000 con un rango de escaneo de 70 a 1000 m/. z. Se utilizó el software patentado Metabolon® para comparar muestras experimentales con una biblioteca de referencia de estándares de identificación de Nivel 1 según lo definido por la Iniciativa de Estándares de Metabolómica, y el área bajo la curva se usó para la cuantificación de picos. Los valores están normalizados en términos de recuentos de área sin procesar y todas las muestras se analizaron en un lote, por lo que no fue necesaria ninguna corrección del lote. Los compuestos desconocidos no tienen un estándar, y las moléculas parcialmente caracterizadas son aquellas que no han sido confirmadas oficialmente con base en un estándar o para las cuales no hay un estándar disponible, pero Metabolon® tiene una confianza razonable en su identidad.

4.4. Procesamiento de datos

Los datos sin procesar se normalizaron por osmolalidad para cada muestra y los datos para cada metabolito se centraron en la mediana en 1 (los datos sin procesar, incluida la osmolalidad, están disponibles en el archivo complementario S1). Los valores faltantes se imputaron con el valor mínimo, excepto para los medicamentos que se imputaron como 0. Los datos se transformaron log10 con una transformación estabilizadora de la varianza (MetaboanalystR) [65,66]. Inicialmente se midieron un total de 1403 metabolitos. Los metabolitos se filtraron de acuerdo con la regla modificada del 80%: se incluyó un compuesto si se detectó en al menos el 80% de las muestras en cualquiera de los grupos EM/SFC o de control [27]. En total, 1154 metabolitos cumplieron los criterios y se incluyeron en análisis posteriores. El único análisis realizado sin filtrado fue el de las correlaciones con los metabolitos plasmáticos. Las proporciones post-ejercicio/valor inicial para cada metabolito se calcularon en log base 10 como el valor post-ejercicio menos el valor inicial para cada sujeto. Para trazar el gráfico del volcán, los cambios logarítmicos medios (pacientes con EM/SFC frente a controles) se convirtieron a log base 2 utilizando la fórmula de cambio de base.

4.5. Análisis de datos y estadísticas

El análisis estadístico univariante para cada metabolito se realizó utilizando un modelo lineal mixto con efectos fijos del estado de la enfermedad, momento temporal, edad e IMC y un efecto aleatorio del sujeto (paquetes R más inteligentes [67] y medios [68]). Se utilizó el método Benjamini-Hochberg (BH) para corregir la tasa de descubrimiento falso, utilizando q < 0.1 como umbral de significancia. El paquete EnhancedVolcano R se utilizó para los gráficos de volcanes [69].

Se utilizó ChemRICH en R para realizar el análisis de vías no superpuestas con las subvías definidas por Metabolon® y el orden de las vías [29]. Se utilizó la herramienta web ChemRICH para realizar el análisis de agrupamiento de similitudes químicas [30]. Para ese análisis, solo se pudieron incluir compuestos que tenían un código SMILES conocido, para un total de 516 compuestos. Para ambos análisis de ChemRICH, las estadísticas de enriquecimiento se realizaron utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov, que no utiliza un límite de significancia del valor p sino que compara la distribución de probabilidad con una distribución de probabilidad de hipótesis nula [70]. Para las subvías de Metabolon®, se seleccionó q < 0. 05 como umbral de significancia y se seleccionó q < 0,15 para los grupos químicos (corrección BH FDR). Para ambos, todos los grupos por debajo de los umbrales q elegidos también tuvieron p <0,05.

El enriquecimiento de la ruta y el análisis de topología se realizaron utilizando la herramienta web Metaboanalyst 5.0 [65], para los metabolomas de referencia humanos KEGG y SMPDB con los siguientes parámetros seleccionados: una prueba global para la prueba estadística y centralidad de intermediación relativa como la medida de importancia del nodo. Los compuestos se incluyeron en este análisis si la ID de HMDB proporcionada por Metabolon® coincidía con la ID de HMDB en Metaboanalyst. Para compuestos duplicados para una ID de HMDB, solo se incluyó el primero. Esto dio como resultado 453 compuestos incluidos.

La agrupación de los sujetos que utilizaron los cuatro compuestos que eran significativamente diferentes entre los pacientes y los controles después del ejercicio se realizó mediante agrupación jerárquica, con la distancia euclidiana como métrica de distancia y el método "Ward.D2" (paquete Heatmap R [71 ]).

Las correlaciones de Pearson entre orina y plasma para 727 metabolitos medidos en ambos biofluidos se realizaron en R (paquete hmisc). Los valores p se calcularon para cada correlación utilizando una prueba t con la hipótesis nula de que el coeficiente de correlación es igual a 0, seguida de la corrección de BH FDR con q < 0.15 como umbral de significancia. Para la Figura 8, se seleccionaron compuestos para eliminar aquellos que tenían valores atípicos extremos utilizando el método de puntuación z modificado, que calcula una puntuación z utilizando la mediana y la desviación absoluta de la mediana (paquete R de valores atípicos, umbral z=6).

A menos que se especifique lo contrario, todas las visualizaciones de datos se realizaron utilizando el paquete R ggplot2. Se eligió la corrección BH FDR para todos los análisis en lugar de la corrección más estricta de Benjamini y Yekutieli FDR porque se encontró que un número extremadamente pequeño de compuestos eran colineales (0. El 75 % de los objetivos tenía un valor absoluto: coeficiente de correlación de Pearson > { {3}}.7).

5. Conclusiones

En general, hubo diferencias significativas en el metaboloma de la orina en los controles sedentarios sanos y en los pacientes con EM/SFC en respuesta a una prueba de CPET en una amplia gama de supervías y subvías metabólicas, que abarcan aminoácidos, lípidos, carbohidratos, nucleótidos, xenobióticos y incógnitas. Estas vías están involucradas en una multitud de funciones fisiológicas que incluyen, entre otras, el metabolismo energético. Esto indica que los pacientes con EM/SFC tienen una desregulación metabólica general que es parte de su intolerancia al ejercicio y PEM en la que la excreción metabólica alterada es un factor contribuyente. Nuestros datos sugieren que el metabolismo de los individuos sedentarios que no tienen EM/SFC experimenta cambios importantes que les permiten recuperarse del esfuerzo, mientras que los pacientes con EM/SFC no logran generar respuestas adaptativas similares. El trabajo futuro incluirá ampliar este estudio a una cohorte mucho más grande que incluya a ambos sexos para validar estos resultados, examinar las diferencias de sexo en el metaboloma de la orina y explorar si existen diferencias más sutiles en los metabolitos urinarios en pacientes con EM/SFC al inicio del estudio que podrían potencialmente contribuir a una prueba diagnóstica de la enfermedad en el futuro.

Contribuciones de autor:Conceptualización, AG, KAG y MRH; metodología, AG, KAG, YVH y MRH; análisis formal, KAG, AG y YVH; investigación, KAG, AG y YVH; redacción: preparación del borrador original, KAG, AG y MRH; redacción: revisión y edición, todos los autores; visualización, KAG y AG; administración de proyectos, MRH; adquisición de financiación, MRH Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS), NIH (U54NS105541) y la Fundación Amar. El Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales de los NIH proporcionó fondos para que el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Medicina Weill Cornell (CTSC) mantuviera la base de datos REDCap a través de UL1 TR 002384.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:El estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ithaca College, Ithaca, Nueva York, EE. UU. (protocolo 1017-12Dx2) y la Junta de Revisión Institucional de Weill Cornell Medical College ( protocolo 1708018518).

Declaración de consentimiento informado:Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio.

Declaración de disponibilidad de datos:Todos los datos de metabolitos de cada sujeto están disponibles en los archivos de datos complementarios proporcionados.

Expresiones de gratitud:Carl Franconi administró la base de datos y el biobanco de la Universidad de Cornell. Las muestras de sangre fueron fraccionadas por David Wang de EVMED Research con el apoyo de la Fundación Workwell y por Ivan Falsztyn, Carl Franconi, Ludovic Giloteaux, Madeline McCanne, Jineet Patel, Adam O'Neal, Alexandra Mandarano, Jessica Maya y Shannon Appelquist en la Universidad de Cornell. Agradecemos a las siguientes personas que participaron en la evaluación de los participantes, realizaron pruebas de ejercicio y/o recolectaron sangre y orina: Betsy Keller, John Chia, Jared Stevens, Tiffany Ong y Maria Russell.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito; o en la decisión de publicar los resultados.

Referencias

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