Un estudio proteómico cuantitativo desenmascara la vía del fibrinógeno en la enfermedad poliquística del hígado
Nov 21, 2023
Abstracto:(1) Antecedentes: La enfermedad poliquística hepática (EPL) es un grupo heterogéneo de trastornos congénitos caracterizados por dilatación de los conductos biliares y desarrollo de quistes derivados de colangiocitos. Sin embargo, actualmente se desconoce el mecanismo de la cistogénesis y el tratamiento de la PLD se limita al trasplante de hígado. Por lo tanto, se necesitan enfoques terapéuticos novedosos y eficientes. En este contexto, el presente trabajo tiene como objetivo principal encontrar nuevas vías moleculares, así como nuevas dianas terapéuticas, implicadas en el proceso de cistogénesis hepática. (2) Métodos: Se realizó proteómica cuantitativa basada en tecnología SWATH-MS comparando proteomas hepáticos deTipo salvajee hígados mutantes/poliquísticos en unpoliquistosis renal(PKD) modelo murino (Pkd1cond/cond; Tam Cre−/+). (3) Resultados: Identificamos varias proteínas alteradas en abundancia, con un límite doble de regulación positiva o negativa y un límite ajustadop-valor relacionado significativamente con la cistogénesis hepática. Luego, realizamos un enriquecimiento y un análisis proteína-proteína identificando un grupo centrado en fibrinógenos hepáticos. Finalmente, validamos una selección de objetivos mediante RT-qPCR,transferencia Western,e inmunohistoquímica, encontrando una alta correlación con datos de proteómica cuantitativa y validando el complejo de fibrinógeno. (4) Conclusiones: Este trabajo identificó una nueva vía molecular en la enfermedad quística del hígado, destacando el complejo de fibrinógeno como una posible nueva diana terapéutica para la PLD.
Palabras clave:PLD; ANDANA; proteómica cuantitativa; dianas terapéuticas
1. Introducción
Enfermedad poliquística del hígado(PLD) es un grupo heterogéneo de trastornos congénitos caracterizados por dilatación de la vía biliar y desarrollo de quistes derivados de colangiocitos (células epiteliales de la vía biliar). Los numerosos quistes se diseminan y progresan por todo el parénquima hepático comprometiendo su función [1]. Los PLD se heredan en forma dominante o recesiva y pueden ocurrir de forma aislada (enfermedad poliquística del hígado aisladaoPLD) o, más comúnmente, comomanifestación extrarrenalde autosomaenfermedad renal poliquística dominante en adultos(PKD) [2]. Enenfermedad renal poliquística autosómica dominante(PQRAD), ~85% de los pacientes desarrollan quistes hepáticos en todo el parénquima hepático y su gravedad puede variar desde unos pocos quistes hasta una cistogénesis hepática grave [3,4]. Mientras tanto enenfermedad renal poliquística autosómica recesiva(ARPKD), podrían desarrollarse quistes hepáticos, pero la principal complicación hepática es una remodelación defectuosa de la placa ductal con fibrosis hepática congénita [5,6]. Para ambos, la PLD es la principal manifestación extrarrenal y requiere manejo y tratamiento clínico [2,5]. El principal enfoque clínico para los pacientes con PLD es reducir sus síntomas clínicos. El manejo de las complicaciones de la vía biliar es la principal característica clínica a controlar, y la estrategia de tratamiento final suele ser el trasplante de hígado [7], ya que no existe un tratamiento farmacológico eficaz para la PLD [2,5]. Se han asociado múltiples vías moleculares con la enfermedad [8], como aumento de la secreción de líquido [9,10], proliferación [11], fibrosis [12,13], defectos ciliares [14] y otros [7,8]; pero el mecanismo principal de la cistogénesis aún no se ha dilucidado. Se requiere urgentemente la identificación de nuevas dianas terapéuticas potenciales. Todos estos estudios se basaron en estudios moleculares utilizando diferentes herramientas moleculares clásicas: cultivo celular 3D [7,8], inmunohistoquímica [7–9,11,12], ELISA [9,11], microscopía electrónica de transmisión (TEM) [12]. , inmunocitoquímica [11], RT-qPCR (PCR cuantitativa en tiempo real) [7,8,10,11] y Western blot [7,8,10–12]. Abordar el estudio de las enfermedades desde nuevas perspectivas, modelos animales preclínicos bien establecidos y aprovechar las nuevas tecnologías puede ser beneficioso en el descubrimiento de nuevos mecanismos moleculares de las enfermedades para traducir los descubrimientos moleculares en nuevas terapias.
La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) ha sido la tecnología más utilizada para la caracterización de proteomas de enfermedades, así como para la identificación de posibles biomarcadores de enfermedades o la detección de fármacos [15,16]. Una estrategia emergente denominada SWATH–MS (adquisición de ventana secuencial de todos los espectros de iones de fragmentos teóricos–espectrometría de masas) permite una cuantificación reproducible, confiable y de alto rendimiento con hasta miles de proteínas analizadas por muestra biológica, y con la posibilidad de realizar simultáneamente una gran cantidad de ensayos [16,17]. Para esta tecnología, las muestras se digieren con tripsina y se analizan mediante cromatografía líquida acoplada a una cromatografía de masas en tándem que funciona en el modo llamado Adquisición Independiente de Datos (DIA) [16] (ver Material y Métodos). La tecnología SWATH-MS de proteómica de próxima generación permite cuantificar el proteoma e identificar diferencias en la abundancia de proteínas en diferentes muestras y condiciones.
En el presente estudio, realizamos un análisis cuantitativo proteómico diferencial basado en la tecnología SWATH-MS en la enfermedad hepática poliquística a partir de modelos animales mutantes. Presentamos una lista de proteínas con significación estadística de abundancia diferencial de proteínas, que se caracterizaron por diferentes análisis de enriquecimiento y curación de datos. Finalmente, validamos los datos SWATH identificando y destacando el complejo de fibrinógeno como un nuevo mecanismo de enfermedad y un posible nuevo objetivo terapéutico para la PLD.
2. Materiales y métodos
2.1. Modelo murino
En este estudio, utilizamos un modelo animal murino con eliminación condicional de Pkd1, el C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Cre [18,19]. El modelo Cre-mouse se utilizó como Wild Types (WT) y Cre+ como Mutant (KO). Los genotipos se confirmaron mediante PCR estándar, siguiendo las condiciones y cebadores descritos [18]. La eliminación de Pkd1 se produjo siempre en los días 10 y 11 posnatales (p10 y p11) con una única inyección intraperitoneal de tamoxifeno (10 mg/40 g) (Sigma®, St. Louis, MO, EE. UU. No. T5648), diluido en aceite de maíz. (Sigma–Aldrich®, St. Louis, MO, USA No. C8267), ambos días en la madre de las camadas a inducir. Los animales fueron sacrificados el día 30 postnatal (p30). Los grupos fueron establecidos por diferentes individuos y organizados de forma aleatoria (aleatorización) manteniendo una proporción de 1:1 entre hombres y mujeres en todos los grupos. Se utilizaron rasgos característicos anatómicos para identificar el sexo de los animales. Los ratones fueron alojados en una instalación libre de patógenos (SPF) según las condiciones establecidas por la Universidad de Santiago.
2.2. Extracción y digestión de proteínas.
En el punto de sacrificio p30, los hígados disecados se almacenaron a −80 ◦C. Se trituró todo el hígado en nitrógeno líquido utilizando un mortero enfriado con nitrógeno líquido (DD Biolab®, Barcelona, España No. 088763), asignando la mitad del tejido a la extracción de proteínas y la otra mitad a la extracción de ARN. Los extractos de proteínas se prepararon con tampón de lisis RIPA (TRIS 10 Mm, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, SDS al 0,1%, TRITON X-100 al 1% y desoxicolato de sodio al 1%). También se agregaron inhibidores de proteasa y fosfatasa al 1% (Sigma® No. P8340 y No. P0044). Este lisado de tejido se sometió a un proceso de centrifugación (durante 30 min a 4 ◦C y 14,000 rpm). Luego se recogió el sobrenadante y se cuantificó mediante el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad® No. 5000001). Se concentraron alícuotas de proteínas (100 µg) en una sola banda en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10% (SDSPAGE), se cortaron y se enviaron para digestión manual como se describió anteriormente [20]. Finalmente, los péptidos extraídos se disolvieron en ácido fórmico al 0,1% para su posterior análisis.
2.3. proteómica
2.3.1. Datos DDA
Análisis dependiente Se analizaron 4 µl de cada muestra (más de 4 µg de proteína) mediante un enfoque de adquisición dependiente de datos (DDA) mediante micro-LC-MS/MS. Las muestras se separaron mediante el sistema micro-LC Ekspert nLC425 (Eksigen®, Dublin, CA, EE. UU.) utilizando una columna trampa YMC-TRIART C18 con un tamaño de partícula de 3 mm y un tamaño de poro de 120 Å (YMC Technologies, Teknokroma, Barcelona, España) y una columna Chrom XP C{{10}} mm × 0.30 mm, tamaño de partícula de 3 mm y tamaño de poro de 120 Å (Eksigen® ) a un caudal de 10 µL/min. Los disolventes utilizados fueron el disolvente A (agua, 0,1% de ácido fórmico) y el disolvente B (ACN, 0,1% de ácido fórmico). El gradiente fue de 5% a 95% B durante 30 min, 5 min a 90% B y, finalmente, otros 5 min a 5% B para el equilibrio de la columna, para un tiempo total de 40 min. El espectrómetro de masas acoplado era un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-TOF, 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, EE. UU.) que funcionaba con un sistema de adquisición dependiente de datos en modo de iones positivos. Utilizando el espectrómetro de masas, se realizó un escaneo de 250 ms de 400 a 1250 m/z seguido de experimentos de MS/MS de 100 a 1500 m/z (25 ms de tiempo de adquisición) para un tiempo de ciclo total de 2,8 s. Se agregaron precursores fragmentados a la lista de exclusión dinámica durante 15 s, cualquier ion con carga +1 se excluyó del análisis MS/MS. Las búsquedas en bases de datos y archivos sin formato de MS se combinaron y realizaron utilizando el software ProteinPilot v.5.0.1. (SCIEX®, Framingham, MA, EE. UU.) utilizando una base de datos UniProt Swiss-Prot específica para ratones. Es necesario especificar la alquilación de cisteína con yodoacetamida como modificación fija y la digestión con tripsina. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se estableció en 1 para péptidos y proteínas con una puntuación de confianza superior al 99% [21].
2.3.2. Generación de las Referencias
Biblioteca espectral La biblioteca espectral se realizó mediante un método DDA como se describe anteriormente, pero en lugar de cada muestra independiente, se realizó un conjunto de cada grupo con 4 µL de cada muestra (más de 4 µg de proteína) para obtener proteínas más representativas. identificación en la biblioteca espectral. Todos los archivos sin procesar se lanzaron juntos en la base de datos de Uniprot para obtener la biblioteca espectral utilizando las condiciones piloto de proteínas mencionadas en la sección anterior.
2.3.3. Cuantificación por SWATH y Análisis de Datos
La adquisición SWATH-MS se realizó mediante un método DIA. Utilizamos 4 grupos con 4 réplicas biológicas por grupo y 3 réplicas técnicas por muestra (consulte la Tabla S1 para más detalles). Los tejidos se analizaron y, en todos los casos, se compararon en condiciones de tipo salvaje (de Pkd1cond/cond; ratón Tam-Cre−) y mutante (de Pkd1cond/cond; ratón Tam-Cre+). Se ejecutaron 4 µg de proteína por muestra y réplicas técnicas utilizando un método SWATH. Para cada conjunto de muestras, el ancho de las 100 ventanas variables se optimizó de acuerdo con la densidad iónica encontrada en las ejecuciones de DDA de la biblioteca utilizando una hoja de cálculo de ventana variable Sciex SWATH. Por lo tanto, el método SWATH se basó en un ciclo de repeticiones que consistió en la adquisición de escaneos 100TOF MS/MS (400 a 1500 m/z, modo de alta sensibilidad, tiempo de adquisición de 50 ms) de ventanas de aislamiento de variables precursoras superpuestas secuenciales con anchos. (superposición de 1 m/z) que cubre el rango de masa de 400 a 1250 m/z con un escaneo TOF MS previo (400 a 1500 m/z, tiempo de adquisición de 50 ms) para cada ciclo. El tiempo total del ciclo fue de 6,3 s.
2.3.4. Análisis de los datos
Todas las proteínas de la biblioteca de iones que fueron identificadas por ProteinPilot con un FDR inferior al 1 % se cuantificaron mediante el método SWATH. Una vez que se adquirieron las muestras individuales, PeakView v.2.2 realizó la alineación espectral y la extracción de datos específicos. (SCIEX®, Framingham, MA, EE. UU.) que coincide con la biblioteca espectral de referencia como se describe a continuación [22–26]. Los tiempos de retención de los péptidos que se seleccionaron para cada proteína se realinearon en cada ejecución de acuerdo con los péptidos iRT presentes en cada muestra y se eluyeron a lo largo del eje de tiempo completo. Luego se generaron los cromatogramas de iones extraídos para cada ion del fragmento seleccionado; las áreas de los picos de los péptidos se obtuvieron añadiendo las áreas de los picos de los iones de los fragmentos correspondientes. PeakView calculó un FDR y una puntuación para cada péptido asignado según los componentes cromatográficos y espectrales; sólo se utilizaron péptidos con un FDR inferior al 5% para la cuantificación de proteínas. De manera similar, para obtener las áreas para la cuantificación de proteínas en función de la intensidad de la señal, se seleccionaron hasta 10 péptidos por proteína y siete fragmentos por péptido. Todos los péptidos compartidos y modificados fueron excluidos del procesamiento. Se utilizaron ventanas de cinco minutos y anchos de 30 ppm para extraer los cromatogramas iónicos.
2.3.5. Análisis de la vía de señalización
Se realizaron diferentes análisis funcionales utilizando proteínas expresadas diferencialmente para evaluar las redes de interacción más relevantes, vías o componentes celulares relacionados y otras proteínas o vías asociadas. Se utilizaron los números de acceso de proteínas UniProt (https://www.uniprot.org/, 28 de agosto de 2021). Las proteínas con diferencias en la abundancia de proteínas se sometieron a: String® (https://string-db.org/, 25 de octubre de 2021) utilizando términos de Gene Ontology (GO) y FunRich® (http://funrich.org/index.html , 21 de octubre de 2021) para estudiar las redes de proteínas y la asociación biológica entre proteínas; y a Reactome® (https://reactome.org/, 25 de octubre de 2021) para estudiar las vías implicadas en relación o interacción con proteínas expresadas significativamente.
2.4. Histología y medición del índice quístico.
El lóbulo más grande del hígado de los animales siempre se fijó en paraformaldehído (solución tamponada de paraformaldehído al 4%, pH=7, Labbox No. FORM-D0P-10K) durante la noche a 4 ◦C. Luego los hígados se deshidrataron con xileno y etanol y finalmente se incluyeron en parafina. Se recogieron secciones transversales de 4,5 µm. Para la tinción con hematoxilina-eosina (HE) y tricrómico de Masson se utilizaron protocolos estándar.
Para las cuantificaciones, siempre se tomaron diapositivas de secciones longitudinales del lóbulo mayor del hígado como imágenes representativas, y para la cuantificación se utilizaron al menos seis secciones diferentes por animal, visualizadas bajo un microscopio Olympus BX51 conectado a una cámara Olympus DP70. índice quístico y varios quistes. La cuantificación de ambos parámetros se calculó con una herramienta de software de reconocimiento automático de quistes llamada CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser, 1 de julio de 2020) como se describió anteriormente [35].
2.5. Química Clínica
Se recogió sangre antes de la eutanasia y se obtuvo suero utilizando tubos BD Vacutainer SST II Advance. La alanina transaminasa (ALT) y la fosfatasa alcalina (ALP) séricas se midieron utilizando el sistema químico ADVIA 2400 (Siemens Healthineers, Erlangen, Alemania).
2.6. Extracción de ARN
El ARN se aisló como se describió anteriormente [36] utilizando el protocolo TRIzol (TRI Reagent, Sigma®, St. Louis, MO, EE. UU., No. T9424), en el que el cloroformo (Sigma® No. C2432) sirvió como agente desnaturalizante de las células. y el isopropanol (Sigma® No. 650447) fue el agente precipitante del ARN. El precipitado se diluyó en agua DEPC (Ambion®, Austin, TX, EE. UU., No. AM9920), que también contiene 1 % de inhibidor de ARNasa SUPERasaIn (Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE. UU., No. AM2694).
2.7. PCR cuantitativa en tiempo real
Se trató un microgramo de ARN hepático total con ADNasa I (Invitrogen®, Carlsbad, CA, EE. UU., n.º 18068015). Luego, se realizó la transcripción inversa con el kit SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen®, No. 18080051) y el análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® No. 04913914001 ) en un sistema Mx3005P (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los cebadores utilizados para este estudio se diseñaron con Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 11 de marzo de 2020) y se basan en las secuencias de referencia de ADNc publicadas en el navegador del genoma Ensembl (http://www.ensembl.org /index.html, 11 de marzo de 2020). Las secuencias completas de todos los cebadores utilizados en el estudio se encuentran en la Tabla S2. Se utilizó el siguiente programa para todas las reacciones de PCR completas: un paso de desnaturalización con 30 s a 95 ◦C; 45 ciclos de 30 s a 95 ◦C, 1 min a 60 ◦C y 30 s a 72 ◦C; seguido de una etapa de enfriamiento. Como hemos realizado anteriormente [36], cada muestra (n=6 para cada grupo) se ejecutó por triplicado en cada experimento. Los resultados se analizaron mediante el método de cuantificación absoluta. En consecuencia, en el ensayo se utilizó una curva estándar con concentraciones conocidas y, además, cada muestra se normalizó a un gen de expresión constante. En este estudio, se utilizó el gen Gapdh (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) como gen de mantenimiento.
2.8. Transferencia Western
Se realizaron ensayos de transferencia Western en lisados de hígado completo. El contenido total de proteínas se determinó mediante el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad®, Hercules, CA, EE. UU., n.º 5000001) y se determinó la misma cantidad de cada proteína (20–30 µg). se hirvieron a 95 ◦C durante 5 min y se separaron en SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras. Se utilizó la escalera de proteínas preteñida PageRulerTM (Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE. UU., n.º 26616) como estándar de peso molecular de la proteína. Posteriormente, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad® No. 1620115). Para evitar la unión no específica, las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente utilizando una solución de BSA al 2,5 % (NZYTech®, Lisboa, Portugal, n.º MB046) para proteínas fosforiladas o un tampón de bloqueo SuperBlock (Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE.UU., nº 37515). Posteriormente, las membranas se incubaron durante la noche a 4◦C con anticuerpos primarios y luego se lavaron con Tween-20 al 0,3% en PBS. Finalmente, las membranas de nitrocelulosa se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios unidos a HRP. Las señales se desarrollaron con el kit de sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE. UU., n.° 34580) o el kit de sustrato de transferencia Western PierceTM ECL (Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE. UU. n.° 32109) antes a la visualización en el sistema de imágenes ChemiDoc™ (Bio-Rad®, Hercules, CA, EE. UU.). Las bandas de proteínas se cuantificaron utilizando el software ImageJ® Lab (v 4.0.1, https://imagej.nih.gov/ij/, 26 de marzo de 2021). Los niveles de densitometría de proteínas se normalizaron a las proteínas de mantenimiento GAPDH o -ACTIN. Para cada grupo. Se utilizó N=6 en todos los experimentos.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios para la transferencia Western: anti-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, EE. UU. #sc-28385), anti -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, EE. UU., No. sc-393948), anti-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotech nology Inc.®, Dallas, TX, EE. UU., No. sc-271035), anti-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, EE. UU., No. sc-398806), anti-FIBG (1:500 , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, EE. UU., No. sc-133157), anti-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE. UU., No. 113442), anti-GAPDH (1:1000, Cusabio®, Houston, TX, EE. UU., No. CSB-RA009232A0HU) y anti- -ACTINA (1:1000, Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, EE. UU., No. 8457), como así como el anticuerpo secundario IgG HRP anti-conejo de cabra (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE. UU., n.° 31460) o IgG HRP anti-ratón de cabra (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE.UU., nº 31430).
2.9. Inmunohistoquímica y Cuantificación.
Para la inmunohistoquímica, se utilizó tampón citrato de sodio pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, Dinamarca No. S2369) para la recuperación de antígenos y el tejido se bloqueó con diluyente de anticuerpos (Agilent Dako® No. K8006). El anticuerpo utilizado para el análisis inmunohistoquímico fue fibrinógeno (Agilent Dako® No. A0080) y el sistema de detección conjugado con HPR para la inmunodetección. Finalmente, la cuantificación de inmunohistoquímica se realizó mediante la función "Canales divididos" (canal verde) del software Fiji-ImageJ® (https://imagej.net/software/fiji/, 13 de octubre de 2021). Para cada muestra se utilizó n mayor o igual a 6 imágenes.
2.10. Análisis estadístico
Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 como punto de corte. Se realizó un análisis estadístico multivariado no supervisado mediante análisis de componentes principales (PCA) para comparar los datos entre las muestras.
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