R. Vesicarius L. ejerce un efecto nefroprotector contra el estrés oxidativo inducido por cisplatino
Mar 26, 2022
Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com
MD Mahmudul Hasan1, La mayoría. Sayla Tasmín2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Maryland Abu Reza1y Ariful Haque2*
Resumen
Fondo:El cisplatino es un fármaco anticancerígeno destacado, pero su uso se ha reducido notablemente debido a la nefrotoxicidad grave. R. vicarious L. es una verdura de hoja que se manifiesta con potencial antiangiogénico, antiinflamatorio, antiproliferativo, hepatoprotector y nefroprotector. Por lo tanto, este estudio fue diseñado para inspeccionar su extracto de metanol (RVE) en busca de un posible efecto nefroprotector.
Métodos:Principalmente, in vitro, la actividad antioxidante de RVE se confirmó en base a la aptitud de captación de radicales libres de 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). A partir de entonces, los ratones macho Swiss Albino se trataron con cisplatino (2,5 mg/kg) durante 5 días sucesivos para inducir nefrotoxicidad. La recuperación de la nefrotoxicidad se analizó tratando a los animales con RVE (25, 50 y 100 mg/kg) por vía intraperitoneal (ip) durante los siguientes 5 días consecutivos. Después de completar el tratamiento, se sacrificaron los ratones y se recogieron los riñones. Una parte se homogeneizó en tampón de fosfato de sodio para evaluar el nivel de malondialdehído (MDA), otra parte se usó para evaluar la expresión génica (NQO1, p53 y Bcl-2). Además, se evaluó in vitro la capacidad neutralizadora del peróxido de hidrógeno (H2O2) del RVE en células HK-2. Finalmente, los fitoquímicos bioactivos en RVE se determinaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS).
Resultados:RVE mostró actividad antioxidante in vitro de forma dependiente de la dosis con un valor IC50 de 37,39 ± 1,89 ug/mL.
El tratamiento con RVE notablemente (p < {{0}}.05)="" disminuyó="" el="" contenido="" de="" mda="" en="" el="" tejido="" renal.="" además,="" la="" expresión="" de="" los="" genes="" nqo,="" p53="" y="" bcl-2="" se="" mitigó="" significativamente="" (p="">< 0,05)="" de="" forma="" dependiente="" de="" la="" dosis="" debido="" a="" la="" administración="" de="" rve.="" rve="" significativamente="" (p="">< 0,05)="" revirtió="" el="" nivel="" de="" h2o2="" en="" las="" células="" hk-2="" a="" casi="" normal.="" de="" gc-ms,="" diez="" compuestos="" que="" incluyen="" tres="" antioxidantes="" conocidos="" "4h-pyran-4-uno,="" 2,="" 3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-"="" ,="" "ácido="" hexadecanoico"="" y="" "escualeno".="" el="" extracto="" era="" rico="" en="" un="" alcaloide="">
Conclusión:En general, RVE posee un efecto protector contra el daño renal inducido por cisplatino.
Palabras clave:Cisplatino, R. vicarious, ratones, riñón, células HK-2, estrés oxidativo, gen NQO1
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Introducción
El estrés oxidativo es el resultado de la desproporción entre la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos de defensa antioxidantes regulares [1]. Las reacciones bioquímicas regulares, la exposición frecuente al entorno desfavorable y la ingesta elevada de xenobióticos dan como resultado la producción de ROS [1]. Las ROS interactúan con los residuos de cisteína de las moléculas de señalización sensibles a redox, incluidos los factores de transcripción, las proteínas tirosina fosfatasas y las proteínas quinasas; en consecuencia, la oxidación de los grupos tiol en estos residuos conduce a alteraciones de las proteínas objetivo, las acciones biológicas, las capacidades de señalización, la inmunidad y los paradigmas suplementarios de células vivas/muertas [2]. Las especies químicas que contienen oxígeno y tienen propiedades reactivas se conocen como ROS, que incluyen radicales libres y moléculas no radicales como el superóxido y el H2O2, respectivamente [3]. El estrés oxidativo inducido por ROS está relacionado con la etiología de numerosas enfermedades, incluido el cáncer. La leucemia mieloide aguda (LMA) es un crecimiento canceroso de células sanguíneas dentro de la médula ósea. Los eventos celulares y moleculares que subyacen a la AML incluyen daño en el ADN, propagación clonal, aumento de la muerte celular y mayor inestabilidad genética, que son el resultado del estrés oxidativo inducido por ROS [4]. La fisiología humana ha sido dotada de numerosos mecanismos que pueden generar antioxidantes para ejercer protección contra el estrés oxidativo, lo que lleva a proteger las células de los efectos tóxicos y sirve para la prevención de enfermedades [5]. Sin embargo, las células desarrollan mecanismos endógenos para contrarrestar el estrés oxidativo y conservar las ROS necesarias [6].
NAD(P)H: la quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) es una flavoenzima [7] que puede catalizar la reducción de dos o cuatro electrones y utiliza esta propiedad para desintoxicar las quininas [8]. Puede proteger las células del daño oxidativo manteniendo a un lado el ciclo redox y reduciendo la producción de radicales libres [8]. Además de la desintoxicación de xenobióticos, NQO1 también participa en la neutralización de superóxido, la modulación de la degradación proteasómica de p53 [9], la inhibición de Bcl-2 [10] y una mayor susceptibilidad a la lesión celular [11].
El cisplatino es el primer fármaco contra el cáncer a base de platino aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) [12]. El cisplatino ejerce la apoptosis al inducir el estrés oxidativo y la sobreexpresión del gen supresor de tumores p53 [12]. Varios efectos adversos que incluyen nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, gastrotoxicidad, ototoxicidad, mielosupresión y neurotoxicidad son el resultado del estrés oxidativo inducido por el cisplatino [12]. Estos efectos secundarios han disminuido notablemente el uso de cisplatino, aunque tiene una actividad anticancerígena sobresaliente. Se sabe que el cisplatino induce estrés oxidativo y suprime el gen NQO1 en riñones de ratones [13]. Por lo tanto, la búsqueda y validación de fuentes naturales efectivas de antioxidantes se está convirtiendo en un área de conocimiento. La ingesta de antioxidantes dietéticos derivados de plantas, como flavonoides, carotenoides y compuestos fenólicos, puede conducir a la protección contra enfermedades cardiovasculares, cataratas y cáncer [14].
R. vicarious (Polygonaceae) se conoce como "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" en bengalí [15]. Crece en las zonas desérticas y semidesérticas de Asia, Australia y África del Norte [16]. Es una planta en peligro de extinción poco estudiada en Bangladesh. En Bangladesh, la gente consume la planta entera como verdura después de cocinarla con sal, diferentes especias y aceite. A veces, las personas usan solo las hojas frescas en ensaladas mixtas como alternativa a la lechuga. La hoja cruda es ligeramente agria, pero se vuelve muy agria después de la cocción. Además, normalmente se mezcla una pequeña cantidad de hojas en los platos de pescado durante la cocción para que tengan un sabor ligeramente ácido.
Esta planta se está utilizando como verdura y hierba medicinal en todo el mundo [17]. Las hojas y semillas se utilizan como antídoto para el veneno de serpiente y escorpión, respectivamente [17]. En el tratamiento popular, R. vicarious se ha utilizado durante mucho tiempo en el tratamiento de enfermedades hepáticas, mala digestión, estreñimiento, almorranas, vómitos, flatulencia, problemas cardíacos, dolores, trastornos del bazo, dispepsia, dolor de muelas, bronquitis, asma, sarna, leucoderma, y como un laxante, estomacal, aperitivo, tónico, diurético y analgésico [18]. Esta planta comprende numerosos compuestos biológicamente importantes que incluyen flavonoides, antraquinonas, carotenoides, vitaminas, lípidos y ácidos orgánicos, que son bien conocidos como agentes antioxidantes, antimicrobianos y anticancerígenos [19]. Cada parte de esta planta contiene quercetina (flavonoides) en una cantidad elevada [15]. Esta planta contiene 0.25 mg de vitamina A, 1,33 mg de vitamina C, 2,37 mg de vitamina E [15], 3,38 mg de flavonoides y 5,66 mg de polifenoles [20] por 100 g de peso seco.
Shahat y colegas [21] demostraron efectos antiangiogénicos y antiproliferativos del extracto de metanol (80 por ciento) de la parte aérea de R. vicarious contra el carcinoma hepatocelular en un modelo de rata. Otro estudio mostró el potencial antiangiogénico in vitro del extracto de R. vicarious [22]. El extracto de metanol de R. vicarious completo ejerce protección contra la hepatotoxicidad inducida por tetracloruro de carbono in vivo [23]. El efecto antiinflamatorio en conejos ha sido evidente por el extracto metanólico de hojas de R. vicarious [24]. Un estudio reciente [25] informó el efecto nefroprotector in vivo del extracto etanólico fraccionado de R. vicarious contra la toxicidad de la gentamicina y el dicromato de potasio.
Teniendo en cuenta la información anterior, nuestro objetivo fue inspeccionar el efecto de los extractos de R. vicarious (RVE) en términos de recuperación de la nefrotoxicidad inducida por cisplatino mediante el mantenimiento de la expresión del gen NQO1 en un modelo animal.
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materiales y métodos
Sustancias químicas y reactivos
El cisplatino y el 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) se adquirieron de SIGMA-ALDRICH (EE. UU.).
El kit de ensayo colorimétrico de creatinina (ID de producto: 700 460) se adquirió de Cayman Chemical (EE. UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal bovino (FBS) y el antibiótico (10,000 U/mL de penicilina y 10,000 ug/mL de estreptomicina) se adquirieron de Gibco (Gibco Laboratories, EE.UU). El kit de ensayo ROS-Glo™ H2O2 y GoTaq® qPCR Master Mix se obtuvieron de Promega (EE. UU.). El kit de transcripción inversa TIAN-Script M-MLV se adquirió de TIANGEN (China) y los cebadores de IDT (Integrated DNA Technologies, Malasia). Todos los demás productos químicos y reactivos utilizados en este experimento fueron de grado analítico.
Recolección de muestras de plantas y preparación de extractos.
Se compraron plantas frescas de R. vicarious en un mercado local en Sonadighi, Rajshahi, Bangladesh. El espécimen de planta fue identificado y autenticado por el Dr. Ahmad Humayan Kabir, Departamento de Botánica de la Universidad de Rajshahi, Bangladesh. Un espécimen bajo el comprobante no. 00095 se almacenó en el herbario del Departamento de Botánica de la Universidad de Rajshahi. Las partes aéreas de la planta se limpiaron, se secaron a 37 grados, se molieron hasta obtener un polvo grueso utilizando un secador electrónico y se almacenaron en un recipiente sellado a 4 grados. El polvo fino (10 g) se disolvió en metanol (500 ml). El contenido se sonicó (Soniprep 150, China) a 20 kHz durante 10 min. La filtración del extracto se llevó a cabo utilizando papel de filtro de fibra de vidrio (Macherey NAGEL, GmBH, alemán) con aparato de filtración DURAN (alemán). Finalmente, el filtrado se concentró utilizando un liofilizador (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, EE. UU.). El extracto finalmente se denominó RVE.
Prueba de actividad antioxidante in vitro
La capacidad antioxidante in vitro de RVE se llevó a cabo sobre la base de la eliminación de DPPH como se describió anteriormente [26] con pocas modificaciones. La capacidad de eliminación de radicales DPPH de RVE se evaluó en base a la conversión del color púrpura de DPPH en color amarillo. La mezcla de reacción en cada tubo de microcentrífuga (2 mL) consistió en 950 μL de solución metanólica de radicales DPPH (0,1 mM) y 50 μL de RVE de cinco concentraciones diferentes (200, 500, 1000, 2000 y 4000 ug). /mL metanol) para hacer concentraciones finales de 10, 25, 50, 100 y 200 ug/mL. Como control se mantuvo otro tubo que contenía 50 μL de metanol y 950 μL de solución metanólica de DPPH. Los tubos de ensayo se dejaron durante 30 min en un lugar oscuro. La absorbancia de las mezclas se tomó a 517 nm utilizando el espectrofotómetro GENESYS 10S UV-VIS (Thermo SCIENTIFIC, EE. UU.). Finalmente, el porcentaje de actividad de eliminación de radicales (RSA) se calculó en función de la decoloración de DPPH utilizando la siguiente fórmula porcentaje de RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100 donde ADPPH es la absorbancia de la solución de DPPH (control) y ARVE es la absorbancia de la solución RVE. La concentración a la que RVE dio como resultado un 50 por ciento de RSA se denominó valor IC50 y se calculó utilizando un gráfico que colocaba el porcentaje de RSA frente a las diferentes concentraciones de RVE utilizadas.
Animales de experimentación y diseño experimental.
Ratones albinos suizos macho de 42 días de edad (30-32 g de peso corporal) se aclimataron durante 1 semana antes de comenzar el experimento en una habitación (temperatura de aproximadamente 25 ± 2 grados y ~ 50 por ciento de humedad, 12 h ciclo de oscuridad/luz). El agua potable y la comida se proporcionaron ad libitum.
Los ratones se separaron al azar en ocho grupos (n {{0}}). El primer grupo (control) se trató con 0,2 ml de NaCl al 0,9 por ciento. Los siguientes cuatro grupos fueron tratados con cisplatino a 2,5 mg/kg durante 5 días con un intervalo de 24 h. Después de la administración de cisplatino, un grupo (segundo grupo) se quedó sin más tratamiento y se asignó como grupo de control estresado. Los grupos tercero, cuarto y quinto fueron tratados adicionalmente con RVE a 25, 50 y 100 mg/kg, respectivamente, durante 5 días. Otros tres grupos fueron tratados con RVE solo a 25, 50 y 100 mg/kg, respectivamente, durante 5 días. Cisplatino y RVE se disolvieron en agua destilada. Todos los tratamientos se administraron por vía intraperitoneal. Después de 24 h del último tratamiento, los animales fueron sacrificados después de la dislocación cervical [25]. Luego se abrió el peritoneo con tijeras, se recogió sangre después de una punción cardíaca y se recolectaron los riñones con fórceps. Se sometió sangre para comprobar el nivel de creatinina en suero. Los riñones se sometieron a evaluación del nivel de malondialdehído y la expresión génica.
Medición de la creatinina sérica
La creatinina sérica se midió utilizando el kit de ensayo colorimétrico de creatinina-700, 460 (Cayman Chemical, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante proporcionado con el kit.
Medición de la peroxidación lipídica renal
El malondialdehído (MDA) es un producto final de la peroxidación de lípidos en el tejido renal y, por lo general, se mide como un indicador de la producción de ROS. Sin embargo, el nivel de MDA se midió en tejido renal según un estudio previo [27]. En primer lugar, el tejido renal se homogeneizó en tampón de fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,4). Se añadió una solución de reacción que comprendía 00,8 % de ácido tiobarbitúrico (1,5 ml), 8,1 % de SDS (200 μl), 20 % (pH 3,5) de ácido acético (1,5 ml) y dH2O (600 μl) a 100 μL de tejido homogeneizado, y luego la mezcla se incubó a 95 grados durante 1 h. Después de enfriar, las mezclas se centrifugaron a 10,000 g durante 10 min a 4 grados y se midió la absorbancia del sobrenadante a 532 nm con tetrametoxipropano estándar 1, 1, 3, 3-. La cantidad de proteína total se midió usando el kit Bradford Protein Assay (BIO-RAD, EE. UU.) y comparándola con la albúmina de suero bovino estándar (BSA). La intensidad de los peróxidos de lípidos se articuló como nanomoles (nM) de MDA por miligramo (mg) de proteína.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real)
La PCR en tiempo real se realizó como se describió anteriormente [28, 29]. El ARN total del tejido renal se aisló utilizando el reactivo TRIzol® (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. A continuación, el ARN aislado (1 ug) se convirtió en ADNc. En primer lugar, se tomaron 2 μL de hexámero aleatorio (10 μM), 2 μL de dNTP (10 mM), 1 ug de ARN y HO libre de nucleasas hasta 15 μL y se incubaron durante 5 min a 70 grados. La mezcla se colocó instantáneamente en hielo durante 2 min. Luego se agregaron 4 μL de tampón de la primera cadena (5x) y 1 μL de transcriptasa inversa M-MLV en cada tubo y se incubaron durante 10 min y 50
min a 25 grados y 42 grados, respectivamente. Finalmente, la enzima transcriptasa inversa M-MLV se inactivó incubando la mezcla a 95 grados durante 5 min. Los productos de ADNc sintetizados se sometieron a PCR en tiempo real para la cuantificación de la expresión génica de NQO1, p53 y Bcl-2 utilizando cebadores específicos (Tabla 1). Cada reacción (10 μL) se realizó por triplicado y constaba de 5 μL de GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, EE. UU.), 0,5 μL (10 mM) de cada cebador, 3 μL de agua libre de nucleasas y 1 μl de ADNc en 48-placas de reacción de pocillos. Los ciclos térmicos se realizaron utilizando una máquina de PCR en tiempo real (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, EE. UU.) con las siguientes condiciones de ciclo: 95 grados durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 grados durante 30 s, 50 grados durante 30 s y 72 grados durante 25 s. La especificidad de las reacciones de PCR se confirmó analizando la curva de fusión a 95 grados durante 15 segundos, 45 grados durante 15 segundos y 95 grados durante 15 segundos. La especificidad de las reacciones de PCR se confirmó analizando la curva de fusión a 95 grados durante 15 segundos, 45 grados durante 15 segundos y 95 grados durante 15 segundos. La cuantificación relativa de la expresión génica se realizó utilizando el gen GAPDH endógeno como control basado en el método ΔΔCq.
Cultivo celular y tratamiento.
La línea celular epitelial del túbulo proximal renal humano, células HK-2, se mantuvo en DMEM suplementado con FBS al 10 % y antibióticos (50 U/mL de penicilina y 50 ug/mL de estreptomicina) en una incubadora con 5 % de CO2 y 95 por ciento de humedad a 37 grados.
Ensayo de medición de H2O2
El nivel de H2O2 en las células HK-2 se estimó utilizando el kit de ensayo de H2O2 ROS-Glo™ (Promega, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante del kit. Se colocaron células HK-2 (1000 células) en 70 μl de DMEM en pocillos de la placa de microtitulación de 96-pocillos. Después de permitir la unión de las células a la superficie de la pared, se reemplazaron 10 μL de DMEM de los pocillos de la placa de microtitulación con 10 μL de cisplatino (25 μM en DMEM) y se mantuvieron en una incubadora durante 12 h. Luego, se agregaron 10 μL de RVE para obtener concentraciones finales de 125, 250 y 500 ug/mL en DMEM y se incubaron durante 12 h más. Después de eso, se agregaron a cada pocillo 20 μL de solución de sustrato de H2O2 y 100 μL de solución de detección ROS-Glo™. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. Finalmente, la luminiscencia se midió utilizando GloMax Luminometer (Promega, EE. UU.).
Análisis GC-MS
El análisis GC-MS de RVE (disuelto en metanol) se realizó como se describió anteriormente [30] usando GCMS-QP2020 (SHIMADZU) que comprende un muestreador automático (AOC{ {5}}s), un autoinyector (AOC-20i) y un cromatógrafo de gases (GC-2010 Plus) conectados a un espectrómetro de masas equipado con un SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Columna capilar Sil MS (30 m × 0,25 μm DI × 0,25 μm DF). El gas portador helio se mantuvo a un caudal constante de 1,72 ml/min y se sometió a un volumen de inyección de 5 μl con una relación de división de 10:1. La temperatura del inyector se mantuvo a 220 grados, la temperatura de la fuente de iones fue de 280 grados, la temperatura del horno se programó desde 80 grados (mantener durante 2 min), con un aumento de 5 grados/min a 150 grados (mantener el tiempo 5,0). min), luego 5 grados/min a 280 grados, terminando con una isoterma de 8 min a 280 grados. Los espectros de masas se tomaron a 1,5 kV con un intervalo de exploración de 0,5 s y la muestra se ejecutó en un rango de 45 a 350 m/z. El retraso del solvente fue de 0 a 3 min, y el tiempo total de ejecución de GC-MS fue de 55 min. La concentración relativa de los compuestos detectados se midió comparando su área máxima promedio con el área total. La interpretación del espectro de masas en GC-MS se realizó utilizando las bases de datos del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST), incluidas NIST08, NIST08s y NIST14.
análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA siguiendo la prueba T3 de Dunnett utilizando el software IBM SPPS (versión 20). Los datos se articulan como media ± desviación estándar (DE). La comparación significativa se consideró en p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Resultados
Prueba de actividad antioxidante in vitro
Aunque anteriormente se informó que RVE tiene actividad antioxidante, volvimos a verificar la actividad antioxidante de nuestro extracto utilizando la capacidad de eliminación de radicales libres de DPPH. RVE neutralizó la DPPH de forma dosis-dependiente (fig. 1). RVE reveló una considerable actividad antioxidante in vitro y el valor IC50 calculado de RVE fue de 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Medición de la creatinina sérica
El nivel de creatinina sérica en ratones aumentó significativamente (p < {{0}}.05)="" después="" de="" la="" administración="" de="" cisplatino="" (tabla="" 2).="" el="" tratamiento="" con="" rve="" mejoró="" notablemente="" (p="">< 0,05)="" el="" nivel="" de="" creatinina="" de="" forma="" dependiente="" de="" la="" dosis="" (tabla="">
Medición de la peroxidación lipídica renal
Comparado con el control, el cisplatino aumentó considerablemente (p < {{0}}.05)="" el="" contenido="" de="" mda="" en="" tejido="" renal="" de="" ratones="" (tabla="" 3).="" por="" el="" contrario,="" el="" tratamiento="" con="" rve="" restauró="" considerablemente="" (p="">< 0,05)="" la="" mda="" casi="" a="" la="" normalidad="" de="" forma="" dependiente="" de="" la="" dosis="" (tabla="">
PCR en tiempo real
El cisplatino disminuyó significativamente (p < {{0}}.05)="" la="" expresión="" del="" arnm="" de="" nqo1="" en="" 0.15-veces="" y="" aumentó="" el="" arnm="" de="" p53="" y="" bcl-2="" expresión="" por="" 24="" y="" 4.2-veces,="" respectivamente="" (fig.="" 2).="" rve="" considerablemente="" (p="">< 0.05)="" mitigó="" la="" expresión="" de="" arnm="" de="" nqo1,="" p53="" y="" bcl-2="" de="" forma="" dependiente="" de="" la="" dosis="" (fig.="" 2).="" en="" comparación="" con="" el="" único="" grupo="" tratado="" con="" cisplatino,="" la="" expresión="" del="" arnm="" de="" nqo1="" aumentó="" en="" 3,57,="" 6,36="" y="" 9.28-veces="" en="" 25,="" 50="" y="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectivamente="" (fig.="" 2a).="" nuevamente,="" la="" expresión="" del="" arnm="" de="" p53="" disminuyó="" 0.63,="" 0.46="" y="" 0.21-="" veces="" a="" 25,="" 50="" y="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectivamente="" (fig.="" 2b).="" la="" expresión="" de="" arnm="" de="" bcl-2="" también="" se="" redujo="" en="" 0,71,="" 0,40="" y="" 0,32-veces="" a="" 25,="" 50="" y="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectivamente="" (fig.="" 2c).="" pero="" no="" se="" encontraron="" cambios="" significativos="" (p=""> 0.05) en el nivel de expresión de los genes NQO1, p53 y Bcl-2 debido al tratamiento con RVE (Fig. 3).
H2O2ensayo de medición
En el ensayo de medición de H2O2, el H2O2el nivel se consideró proporcional a la luminiscencia. La administración de cisplatino aumentó significativamente (p < {{0}}.05)="" el="" nivel="" de="" h2o2="" en="" 2.2-veces="" (fig.="" 4).="" el="" tratamiento="" con="" rve="" disminuyó="" considerablemente="" (p="">< 0.05)="" el="" nivel="" de="" h2o2="" en="" 0,25,="" 0,38="" y="" 0,49-veces="" a="" 125,="" 250="" y="" 500="" ug/ml,="">
Análisis GC-MS
Un total de 10 compuestos (Tabla 4 y Fig. 5) que incluyen "Isoborneol, éter de pentametildisilanilo (alcohol sesquiterpénico)", "Timina (nucleobase de pirimidina)", "4H-Piran-4-ona, 2,{{ 8}}dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil- (saponina)", "Ácido hexadecanoico, éster metílico (éster metílico de ácido graso)", "9,12- Ácido octadecadienoico, éster metílico (éster metílico de ácido graso)", "9-Ácido octadecenoico (Z)-, éster metílico (éster metílico de ácido graso)", "Estearato de metilo (éster metílico de ácido graso)", "Ftalato de diisooctilo (éster)", "13-docosenamida, (Z)- (alcaloide)" y "escualeno (triterpeno)" se detectaron en RVE.
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Discusión
Los antioxidantes naturales y sintéticos se han estudiado exhaustivamente y se ha revelado que son funcionales para la prevención o la mejora de la toxicidad en la fisiología animal [31]. Los suplementos antioxidantes son el componente desarrollado por síntesis química o por extracción de alimentos naturales, pero estos no son idénticos en composición a los antioxidantes disponibles en los alimentos [5]. Por lo tanto, las opiniones difieren con el tiempo si los antioxidantes sintéticos brindan o no beneficios para la salud similares a los antioxidantes naturales [32]. Está surgiendo la necesidad de disminuir el uso de suplementos antioxidantes sintéticos y buscar fuentes alternativas, baratas, renovables, naturales y posiblemente más seguras de antioxidantes naturales efectivos.
Uno de los mecanismos más importantes es la vía del factor nuclear eritroide-2relacionado con el factor-2 (Nrf2) que generalmente protege a las células del estrés oxidativo inducido por factores estresantes exógenos o endógenos [27]. Los antioxidantes efectivos inducen la expresión de Nrf2, que se mueve más hacia el núcleo y se une al elemento de respuesta antioxidante (ARE) que provoca la expresión del gen NQO1 desintoxicante y antioxidante de fase II [33, 34]. NQO1 se expresa amplia y diferencialmente de una manera específica de tejido. NQO1 es una flavoproteína antioxidante citosólica que cataliza la 2-reducción de electrones de quinonas a hidroquinonas, lo que resulta en la desintoxicación de los electrófilos y la anticipación del ciclo redox [35]. Según un estudio anterior [36], la -lapachona activa NQO1, lo que aumenta aún más el nivel de NAD plus intracelular y protege al riñón de la lesión aguda inducida por cisplatino.
Se sabe que el cisplatino induce daño en la membrana de filtración glomerular a través del estrés oxidativo, la inflamación y la apoptosis, lo que en conjunto conduce a una reducción de la tasa de filtración glomerular y a la pérdida de la permeabilidad normal de la membrana [37]. Por lo tanto, el nivel de creatinina sérica se incrementó. La creatinina sérica es uno de los posibles marcadores de funcionalidad renal. El tratamiento con cisplatino aumentó el contenido de MDA en el tejido renal, que es un producto secundario de la peroxidación lipídica y este informe es constante con estudios previos [27, 35, 37, 38]. El tratamiento con RVE redujo significativamente el contenido de MDA en el tejido renal. Al mismo tiempo, el nivel de creatinina también disminuyó, lo que indica el efecto de mejora de RVE.
Además, la expresión de NQO1 disminuyó significativamente y la expresión de p53 y Bcl-2 aumentó significativamente después de la exposición al cisplatino. En términos de expresión de NQO1 y p53 in vivo, nuestro resultado es consistente con un estudio previo [13]. Un estudio reciente [39] mostró que el cisplatino disminuyó significativamente la expresión de Bcl-2 en el riñón de ratones, pero sorprendentemente encontramos una expresión elevada. Esta diferencia puede ser el resultado de la diferencia de dosis [40], ya que Mohamed y colegas [39] usaron 8 mg/kg durante 12 días, mientras que nosotros usamos 2,5 mg/kg durante solo 5 días. Otro estudio [41] indicó que el cisplatino puede aumentar la expresión de Bcl-2 en una dosis en la que no es citotóxico. Una vez más, el aumento de la expresión de Bcl-2 sensibiliza a las células frente al estrés oxidativo [40].
Sin embargo, la expresión de p53 es baja en condiciones fisiológicas normales, pero se espera que aumente una vez tratado con cisplatino porque este agente quimioterapéutico basado en platino activa la vía apoptótica dependiente de p53. Una vez que tratamos a los ratones con cisplatino, p53 aumentó significativamente en los riñones de los ratones en comparación con el control. Otro protooncogen Bcl-2 también se correlaciona con el nivel de expresión de NQO1. Imitando la expresión de p53, también encontramos que los niveles de Bcl- 2 aumentaron con el tratamiento con cisplatino, pero se recuperaron significativamente con el tratamiento con RVE. Esto es posible, en respuesta al estrés oxidativo, el gen p53 se activa y da como resultado la detención del ciclo celular, la senescencia o la apoptosis [6]. Con la desintoxicación, a menudo se considera que la sobreexpresión de NQO1 está relacionada con la apoptosis en las células cancerosas [10], aunque el mecanismo subyacente de la apoptosis y la sobreexpresión de NQO1 sigue siendo controvertido. Además, en el carcinoma hepatocelular, la sobreexpresión de NQO1 disminuye la expresión de Bcl-2 [10]. El protooncogén Bcl- 2 también tiene p53 como la correlación con la expresión de NQO1. p53 es un factor de transcripción específico de secuencia que se activa con numerosos tipos de estrés celular [42], mientras que la sobreexpresión de Bcl-2 actuó como estabilizador de poros mitocondriales para facilitar la liberación de citocromo-c tras el estrés oxidativo [12]. En nuestro caso, verificamos las respuestas de ambos genes con el tratamiento con cisplatino en tejido renal normal y encontramos su expresión aumentada. El tratamiento con RVE revirtió la expresión de p53 y Bcl-2 a casi normal de forma dependiente de la dosis. Este tipo de anulación de la expresión Bcl-2 también se mostró utilizando el eliminador de ROS Trolox [43]. Además, el nivel de H2O2 también aumentó notablemente en las células HK-2 debido al tratamiento con cisplatino in vitro. Después del tratamiento con RVE, el nivel de H2O2 se restauró significativamente a un nivel normal. Esto quizás se deba al efecto del tratamiento con RVE que aumentó la expresión de NQO1 [44], que ejerce protección contra el estrés oxidativo [6].
El cromatograma GC-MS confirmó la existencia de diez compuestos en RVE. Entre estos, "4H-pirano- 4-ona, 2, 3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-", "ácido hexadecanoico" y " El escualeno" son antioxidantes bien conocidos[45–47]. Estos tres compuestos en conjunto posiblemente ejercieron un efecto nefroprotector sinérgico. Estudios previos también informaron sobre la inducción de la expresión de NQO1 por la vitamina A [48], la vitamina C [49], la vitamina E [50], los flavonoides [51] y los polifenoles [50]. Por lo tanto, este informe sugiere dilucidar si este extracto en particular contiene algo entre vitamina A, vitamina C, vitamina E, flavonoides y polifenoles, o no.
Conclusión
El hallazgo general sugiere que RVE es fisiológicamente eficaz para proteger los riñones del daño inducido por cisplatino. Por lo tanto, es crucial dilucidar los compuestos exactos responsables de mitigar la nefrotoxicidad inducida por cisplatino que puede resultar beneficiosa para la aplicación en humanos.
extracto de cistanche tubolosa
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen al Consejo de Investigación Científica e Industrial de Bangladesh (BCSIR), rama de Rajshahi, por brindar apoyo de laboratorio para cuantificar el ARN.
Contribuciones de los autores
MMH realizó diseño experimental, experimentación, análisis y preparación de datos, redacción y edición de manuscritos, revisión y redacción de manuscritos; MST & MME realizaron experimentación y análisis de datos; AME & MAR aportó en supervisión y recursos; AH fue responsable de la conceptualización, supervisión, recursos y edición del manuscrito. Todos los autores
revisó el manuscrito. Los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Fondos
El trabajo actual fue financiado por el Proyecto de Apoyo a Investigadores de la Universidad de Taif número (TURSP - 2020/75), Universidad de Taif, Taif, Arabia Saudita.
Disponibilidad de datos y materiales.
Todos los datos relevantes están disponibles y podrían proporcionarse previa solicitud al autor correspondiente.
Declaraciones
Aprobación ética y consentimiento para participar
La ética para realizar este experimento fue aprobada por el Comité Institucional de Bioseguridad, Bioseguridad y Ética Médica Animal (IAMEBBC), Instituto de Ciencias Biológicas (IBSc), Universidad de Rajshahi, y se proporcionó bajo el memorándum número 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones proporcionadas por el comité de ética mencionado anteriormente. Este estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). El "consentimiento para participar" no se aplica a este estudio.
Detalles del autor
1Laboratorio de Biología Molecular y Ciencias de Proteínas, Departamento de Ingeniería Genética y Biotecnología, Facultad de Ciencias de la Vida y de la Tierra, Universidad de Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 2Laboratorio de Patología Molecular, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 3Departamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Taif, PO Box 11099, Taif 21944, Arabia Saudita. 4Departamento de Genética, Facultad de Agricultura, Universidad de Alejandría, Alejandría 21545, Egipto.
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