Haciendo micro en la enfermedad renal por leptospirosis Ⅱ

4. Respuestas de inmunidad del huésped frente a Leptospira spp.

La principal vía de Leptospira es la penetración directa de mucosas o piel abierta a través de sangre, tejidos, orina o agua contaminada, que se propaga por la circulación sistémica y se disemina a varios órganos, como elhígado, pulmón y túbulo proximal delnefrona en los riñones, donde puede multiplicarse y sobrevivir durante un mes [51]. En la fase inicial de la infección, elrespuesta inmune innatajuega un papel fundamental como primera línea de defensa en la leptospirosis, afectando la respuesta dereceptores de reconocimiento de patrón, fagocitosis de macrófagos, inducción de actividad extracelularacumulación de neutrófilos, yintervención del sistema del complemento [52].

Elrespuesta inmuneen el ser humano juega un papel esencial en ladesarrollo de signos clínicos, al igual que los factores de virulencia de algunas cepas patógenas. La mayor parte de la leptospirosis humana es asintomática o leve, y sólo el 10% de los casos desarrolla formas graves con insuficiencia multiorgánica y mayores tasas de mortalidad relacionadas con una enfermedad.tormenta de citoquinasy un estado de inmunoparálisis. Las especies patógenas estimulan una respuesta humoral en la fase de bacteriemia, aunque el comportamiento posterior de lasrespuesta inmuneno esta claro. En estudios de pacientes con múltiples manifestaciones clínicas de leptospirosis, la gravedad del cuadro clínico se ha asociado con varios niveles de citoquinas séricas, como TNF-, IL-10 e IL-6 [53], pero esta conclusión sigue siendo controvertida [54]. Estas condiciones han generado un mayor interés en comprender la respuesta inmune en general y los eventos biológicos que ocurren durante la infección.

¿CUÁNTO TIEMPO TARDA EN FUNCIONAR CISTANCHE?

4.1. Leptospira y el sistema del complemento

La actividad proteolítica de las proteasas de Leptospiral contra la matriz extracelular permite que la infección ingrese al torrente circulatorio. El sistema del complemento en el sistema circulatorio es uno de los principales mecanismos de la respuesta inmune innata a la Leptospira patógena. Sin embargo, Leptospira ha desarrollado estrategias para escapar del ataque del sistema del complemento uniendo proteínas a moléculas del complemento y produciendo proteasas, como la termolisina, una enzima metaloproteinasa neutra termoestable que afecta la cadena proteica C3. Las cepas patógenas se unen al factor H (FH), a la proteína 1 relacionada con el factor H del complemento (FHR-1), a la proteína 1 similar al factor H (FHL-1) y a la proteína de unión C4b (C4BP), todas de los cuales son responsables de inhibir el sistema del complemento [55]. Existen tres estrategias principales para la evasión del complemento de Leptospira patógena [55,56] mediante la interferencia de los reguladores del complemento del huésped, la proteasa del huésped y la proteasa bacteriana. Para los reguladores del complemento, Leptospira utiliza el factor H (FH; un regulador de la vía alternativa del complemento) y la proteína de unión a C4 (C4BP; un regulador de las vías clásica y de lectina del complemento) para acelerar la descomposición de las convertasas C3 y también actuar como cofactores para el factor I. para la escisión de C3b y C4b [57,58]. La proteína leptospiral (LcpA), junto con la vitronectina (Vn; un regulador de la vía terminal) se une a C9 e inhibe su polimerización [59], bloqueando así potencialmente la formación del complejo activador de membrana (MAC) [60]. Además, la Leptospira patógena se une a varias proteasas del huésped, como el activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA), que induce la plasmina activa [61] (una serina proteasa) para la digestión de C3b, C4b y C5 en la superficie de Leptospira [62]. Además, las metaloproteasas y la termolisina, la proteasa endógena de Leptospira, pueden escindir e inactivar varias proteínas del complemento (C2, C3, C4 y factor B) [60]. La combinación de reguladores del complemento, del huésped y de Leptospira patógena, facilita la colonización bacteriana en los órganos diana del huésped [63].

4.2. Leptospira y neutrófilos

Durante la infección, las especies patógenas de Leptospira desencadenan una fuerte activación de los neutrófilos y una respuesta proinflamatoria. Los neutrófilos son importantes para el control de los microorganismos, pero también contribuyen al daño tisular del huésped. Se ha demostrado que los niveles bajos de acumulación extracelular de neutrófilos debido a la baja actividad de los neutrófilos en la circulación aumentan la leptospiremia, lo que indica que la formación intravascular de reclutamientos de neutrófilos puede ser crítica para prevenir la propagación temprana de Leptospira patógena [64].

4.3. Leptospira y macrófagos

En la fase inicial de la infección por Leptospira, los macrófagos desempeñan un papel importante en la eliminación de la espiroqueta. Este mecanismo efector junto con una respuesta eficiente de citoquinas se relaciona con el control fagocítico y la propagación de la infección, aunque Leptospira spp. Se ha demostrado que induce la apoptosis en macrófagos a través de la vía Fas/FasL-caspasa-8/-3 y facilita su supervivencia y proliferación en el huésped debido a la liberación de apoptosis y endonucleasa inductoras del factor mitocondrial en infectados. macrófagos [65]. Recientemente se han realizado investigaciones sobre el microtranscriptoma de macrófagos infectados con Leptospira para determinar los mecanismos epigenéticos, como la regulación postranscripcional por ARN. Los macrófagos infectados con Leptospira han demostrado que los microARN (miARN) están regulados por la infección con la espiroqueta, lo que demuestra que esta regulación es de vital importancia en la respuesta de estas células del sistema inmunológico en la infección por Leptospira [66]. En los macrófagos humanos, la activación de la inflamación mediada por especies reactivas de oxígeno y catepsina B lisosomal generada por la infección por Leptospira tiene niveles prominentes de NLRP3 e IL-18, favoreciendo la producción de IL-1 y conduciendo a una alta posibilidad de fagocitosis y el modelado rápido de algunas citoquinas correlacionadas con la resistencia a la leptospirosis [67].

4.4. Respuesta humoral a la leptospira

La respuesta humoral específica contra Leptospira se caracteriza por la producción de anticuerpos IgM e IgG al tercer día del inicio de los síntomas. Además, se ha reportado producción de IgA desde el día uno hasta el noveno mes post-infección; de hecho, el aumento de IgM se ha utilizado como medida alternativa en el diagnóstico precoz de la leptospirosis [68]. El efecto de la respuesta humoral en humanos con leptospirosis permite realizar el diagnóstico serológico después de la infección natural [69]. El aspecto más importante de la respuesta humoral en la infección por Leptospira puede ser la formación de anticuerpos protectores. Las vacunas actualmente disponibles para la leptospirosis están compuestas de preparaciones celulares completas y tienen limitaciones, como baja eficacia, múltiples efectos secundarios, baja generación de memoria inmune y falta de protección cruzada para las diferencias de serovares. Por tanto, el desarrollo de nuevas vacunas es necesario para el control de enfermedades y actualmente se están realizando investigaciones para producir vacunas a partir de inmunización genética [70]. Las OMP de Leptospira han sido consideradas un antígeno, con mejor inmunogenicidad para los linfocitos B, que incluyen los epítopos estructurales OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} y LipL41263-282 [71]. Estos epítopos son candidatos prometedores para el desarrollo de una vacuna universal.

4.5. Respuesta inmune adaptativa a Leptospira: células T y citocinas

Las especies patógenas de Leptospira inducen una respuesta inmune mediada por linfocitos T y B, acompañada de la expresión de citoquinas que pueden estar asociadas con gráficos de gravedad. La activación de las células T durante la infección por Leptospira inicia la respuesta inflamatoria, principalmente mediante la producción de citoquinas. Esto es fundamental para la eliminación temprana de la infección, pero la producción incontrolada de citocinas proinflamatorias también puede provocar una sobreproducción de citocinas seguida de un estado de inmunoparálisis, que puede provocar sepsis y fallo multiorgánico. Los linfocitos T producen IL-1, IL-6, IL-12, interferón (IFN)- y TNF-, que funcionan como quimioatrayentes para reclutar leucocitos en el sitio de la infección. Curiosamente, in ex vivo, las células T δ vírgenes proliferaron en cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas con antígenos de Leptospira además de producir IL-17 e IFN [72]. Además, mientras que los ratones de tipo salvaje infectados con leptospirosis demostraron niveles más altos de muchas citocinas, incluidas IL-4, IL-10 e IL-13 en comparación con ratones no infectados, la enfermedad crónica murina inducida por Leptospira nefritis (ratones Daf1-/-) mostró una mayor expresión de actina del músculo liso, IL-10, IL-13, pero no hubo diferencias entre IL-12 e IL{{21} } niveles [73]. Como tal, Daf1 e IL-17 pueden desempeñar un papel protector crucial en la progresión de la ERC como vínculo entre la ERC murina inducida por Leptospira y la fibrosis renal [72,73]. Sin embargo, la hipótesis de la respuesta de citoquinas seleccionadas en la progresión de la enfermedad aún no es concluyente en la leptospirosis humana hasta el momento. En pacientes con leptospirosis grave y afectación pulmonar, se obtuvieron niveles elevados de IL-6, CXCL8 e IL-10 en comparación con pacientes con leptospirosis leve [53]. Estas altas concentraciones de citocinas en pacientes con leptospirosis resaltan su papel clave en el desarrollo de leptospirosis grave.

En pacientes con infección grave se encuentran linfocitos T CD4+ con perfil proinflamatorio y productores de IL-2 e IFN-, mientras que CD4+ CD25 son altos productores de IL-10 están casi ausentes. La regulación de la respuesta inmune mediada por linfocitos T no parece prevenir el daño tisular generado por la respuesta inflamatoria a Leptospira. En los linfocitos T CD4+ de humanos con leptospirosis grave, la producción de TNF y otras citocinas proinflamatorias es mayor que en aquellos con la forma leve de la enfermedad, lo que indica que estas citocinas pueden usarse como marcadores de gravedad en la fase inmunológica de la infección [74]. La producción de IL-10 se ha asociado con el riesgo de muerte en humanos con leptospirosis; sin embargo, un estudio realizado en humanos expuestos y asintomáticos asoció la producción de esta citocina con el control de la respuesta inflamatoria y la supervivencia [74]. Durante la infección por Leptospira, los mediadores inflamatorios y la acción de algunas células leucocitarias, como los linfocitos T, se regulan rápidamente en individuos resistentes, a diferencia de lo que ocurre en individuos con formas graves de leptospirosis [75].

En resumen, la respuesta inmune a la infección por Leptospira no se comprende completamente debido a los comportamientos clínicos de los pacientes con leptospirosis, quienes interactúan con los diferentes factores de virulencia del genoma bacteriano, lo que le confiere a Leptospira una sólida capacidad patogénica.

5. Manifestaciones clínicas

Las manifestaciones clínicas de la leptospirosis son diversas y van desde síntomas leves e inespecíficos, como síntomas similares a los de la gripe (fiebre, mialgia y dolor de cabeza), hasta síntomas graves junto con lesiones orgánicas en etapa terminal (p. ej., IRA, insuficiencia hepática aguda). y diátesis hemorrágica, también conocida como síndrome de Weil), hemoptisis aguda por hemorragia pulmonar, confusión aguda por meningoencefalitis aséptica e insuficiencia cardíaca aguda por miocarditis aguda o subaguda [7]. En consecuencia, los tres indicadores de sospecha de infección por leptospirosis consisten en (i)enfermedad febril aguda, (ii) ictericia, y (iii)Lesión renal aguda[12]. Los factores predictivos de una forma grave de leptospirosis son mialgia intensa al inicio, tendencia hemorrágica intensa e ictericia marcada. Curiosamente, la presencia de ya sea preexistenteenfermedad renal crónica(riñón de tamaño pequeño) o riñones agrandados y congestionados con anuria se relaciona con el peor resultado [12]. Por tanto, los pacientes con enfermedad renal asociada a leptospirosis deben recibir tratamiento oportuno.

6. Diagnóstico

6.1. Diagnostico clinico

El diagnóstico de leptospirosis se basa en los antecedentes de exposición, los factores de riesgo y las manifestaciones clínicas. Un alto índice de sospecha puede evitar daños orgánicos posteriores. Sin embargo, los síntomas de la leptospirosis a menudo se confunden con otras causas del síndrome febril agudo, como la infección por dengue, malaria, hepatitis y enfermedades autoinmunes activas. La falta de signos patognomónicos de leptospirosis significa que el diagnóstico se basa tentativamente en la evaluación de fiebre y mialgia en pacientes de un área endémica. Por este motivo, el diagnóstico de laboratorio de la leptospirosis es fundamental.

6.2. Diagnóstico de laboratorio

La leptospirosis es difícil de diagnosticar en el laboratorio, especialmente durante la fase aguda. Se puede realizar identificando directamente espiroquetas o sus componentes en fluidos o tejidos corporales, aislando leptospiras en cultivo o detectando anticuerpos particulares a lo largo de diferentes fases clínicas. La leptospirosis es difícil de distinguir de enfermedades como la malaria, el dengue, la rickettsia, la influenza, la hepatitis y la fiebre amarilla debido a su vaga apariencia clínica. Como resultado, se necesitan pruebas de laboratorio para confirmar el diagnóstico. La base de estas pruebas (ADN) es la detección de anticuerpos contra las leptospiras, las propias leptospiras o su ácido desoxirribonucleico. El diagnóstico de laboratorio actual incluye tanto la identificación directa (detección de espiroquetas de Leptospira o ADN en las muestras o aislamiento del organismo a partir de muestras) como la detección indirecta (diagnóstico serológico o serología para identificar la infección por Leptospira, que se basa en la detección de anticuerpos específicos contra diversas Antígenos de leptospira) (Tabla 1).

6.2.1. Examen microscópico directo, cultivo y detección de antígenos

Las leptospiras son espirales delgadas, brillantes y activamente móviles con un giro característicamente rápido (motilidad de contracción) bajo el microscopio de campo oscuro convencional (DFM) y se necesitan aproximadamente 10 leptospiras/mL para la detección de una célula por campo. Con una semana más de duración de la infección, hay aproximadamente un 10% de fallecidos en rendimiento de DFM (de 100 a 90%). Para mejorar la sensibilidad, se utilizan varios métodos de tinción especiales; Tinción de Warthin-plata estrellada [76] e inmunotinción (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, captura de antígeno inmunomagnético y tinción con inmunoperoxidasa [77]) que requieren los anticuerpos primarios específicos del serovar (de forma aislada o en combinación).

Tabla 1. Pruebas de laboratorio para el diagnóstico de leptospirosis.

LAMP, amplificación isotérmica mediada por bucle; PCR, reacción en cadena de la polimerasa; NGS, secuenciación de próxima generación; HAI: hemaglutinación indirecta; ELISA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; IgM, inmunoglobulina M; MAT, prueba de aglutinación macroscópica; MCAT, prueba de aglutinación de microcápsulas; ADN, ácido desoxirribonucleico; DFM, microscopía de campo oscuro

Paralelamente, es posible realizar cultivos de Leptospira a partir de sangre, orina, líquido cefalorraquídeo y tejido de biopsia durante los primeros días hasta los 10 días posteriores a la aparición de los síntomas de la enfermedad (etapa de leptospirosis). Debido a que son de crecimiento lento (tiempo de duplicación de 6 a 8 h), fastidiosos y propensos a la contaminación, las muestras de cultivo deben conservarse durante al menos 3 a 4 meses antes de descartarse como negativas) con solo un 23% de sensibilidad, pero es necesario. para la prueba de sensibilidad a los medicamentos [6]. Como tal, el medio EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) (complejo de albúmina oleico) consiste en albúmina sérica bovina (fracción V), Tween 80, cloruro de amonio y tiamina, fosfato monopotásico, fosfato disódico y varios nutrientes [78] es el más utilizado. comúnmente se usa, mientras que los medios más especializados T80/40/LH (polisorbato 40, hidrolizado de lactalbúmina, superóxido dismutasa y suero de conejo) son necesarios para algunos serovares [79]. Para el aislamiento primario de la amplia y diversa gama de leptospiras patógenas fastidiosas, Hornsby-Alt-Nally (HAN) parece ser un buen medio [80].

La detección de antígenos de Leptospiral mediante inmunoperoxidasa, inmunofluorescencia o un sistema de captura de antígeno inmunomagnético se ha desarrollado para muestras con cargas bacterianas bajas o la microscopía de campo oscuro no se puede utilizar, pero no se realiza de forma rutinaria debido a la limitación de los anticuerpos primarios [77]. Por el contrario, el reconocimiento de ácidos nucleicos con una nueva amplificación de ADN; La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (es decir, PCR anidada, PCR cuantitativa [qPCR]), la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y la secuenciación de próxima generación (NGS) son valiosas para un diagnóstico de laboratorio temprano y preciso, especialmente con la Aislamiento de Leptospira mediante inoculación en medios biológicos e hibridación de ADN (sonda de ADN) [81,82]. Se pueden amplificar una variedad de objetivos de leptospiral (como el ARN ribosómico 16S) o ADN para el diagnóstico [83] y la PCR en tiempo real (RT-PCR) es más sensible y específica que la PCR estándar [84]. Debido a que algunos cebadores de RT-PCR pueden unirse a un sitio no específico, lo que genera resultados falsos positivos, los ensayos de PCR multiplex en tiempo real más recientes se han desarrollado utilizando dos conjuntos de cebadores [85]. La PCR anidada también ayuda a detectar sitios de ADN más específicos y sensibles con conjuntos adicionales de cebadores [86, 87). Sin embargo, las tendencias actuales para el diagnóstico de leptospirosis son el uso de técnicas serológicas y moleculares, como la PCR y ELISA (más fácil que el estándar de oro MAT serológico), para países con recursos limitados [88,89]. Además, la técnica LAMP [90] para detectar un gen 16S rRNA (rrs) es rentable, rápida y de alto rendimiento para detectar leptospiras patógenas en la orina. Actualmente, la NGS es el método independiente del cultivo basado con mayor precisión en el análisis del genoma central en fluidos corporales (sangre y orina) [91] y la dirección futura de las pruebas de leptospirosis sería avanzar hacia la clasificación molecular de las leptospiras, que supera la limitación de aislamiento en cultivo de leptospiras a partir de muestras clínicas. Por lo tanto, el valor de la PCR en el diagnóstico clínico de la leptospirosis es particularmente bueno y están surgiendo varias técnicas modernas.

6.2.2. Detección de anticuerpos anti-Leptospira

Se utilizan varios diagnósticos serológicos; por ejemplo, pruebas de anticuerpos específicas de género (hemaglutinación indirecta [IHA], ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA], Lepto Dri Dot [aglutinación de látex], aglutinación en microcápsulas [MCAT]) y pruebas de anticuerpos específicos de serovar (prueba de aglutinación microscópica [ MAT]) [92,93]. Como tal, los criterios MAT para el diagnóstico son (i) un aumento de cuatro veces el título en sueros pareados (seroconversión de la infección actual) o (ii) un único título alto (mayor o igual a 1:400 o 1:800, mayor en casos epidémicos). áreas) (seropositividad) (los anticuerpos pueden persistir durante algún tiempo después de la infección o la reacción cruzada con otras enfermedades). Además, MAT requiere un panel vivo de todos los serovares de Leptospira en la región, con un panel de serovares estandarizados localmente [93,94] siguiendo la Organización Mundial de Sanidad Animal (19 antígenos representativos de 15 serogrupos) [95]. Debido a que los anticuerpos son detectables entre 5 y 7 días después de la infección, la prueba MAT puede ser negativa (título <1:50) durante los primeros días de la infección. El diagnóstico de leptospirosis se puede realizar mediante muestras de orina [96] utilizando tanto serología como detección molecular (ARNr 16S), particularmente en pacientes con infección reciente (MAT mayor o igual a 1:800 o ELISA IgM positivo o ambos) [97] .

Con recursos limitados, una puntuación de predicción clínica [98] basada en la historia clínica relevante y las pruebas de laboratorio relacionadas con puntuación en siete aspectos es la siguiente: hipotensión (3), ictericia (2), dolor muscular (2), IRA (1,5). , se propone hemoglobina baja (3), hipopotasemia con hiponatremia (3) y neutrofilia (1) (una puntuación de corte resumida de 4 tiene el área bajo la curva característica operativa del receptor {{10}}.78 ( IC del 95% 0.68–0,89) para el diagnóstico de leptospirosis [77]). Esta puntuación de probabilidad de admisión de Thai-Lepto podría ser una herramienta de diagnóstico para el diagnóstico presuntivo temprano de leptospirosis en pacientes que presentan una sospecha clínica grave de la enfermedad.