Avances de la investigación y aplicaciones de los anticuerpos proteicos fluorescentes: una revisión centrada en los nanocuerpos

Abstracto: Desde el descubrimiento de las proteínas fluorescentes (FP), sus ricos espectros de fluorescencia y propiedades fotoquímicas han promovido amplias aplicaciones de investigación biológica. Los FP se pueden clasificar en proteína fluorescente verde (GFP) y sus derivados, proteína fluorescente roja (RFP) y sus derivados, y FP del infrarrojo cercano. Con el desarrollo continuo de los PF, han surgido anticuerpos dirigidos a los PF. El anticuerpo, una clase de inmunoglobulina, es el componente principal de la inmunidad humoral que reconoce y se une explícitamente a los antígenos. Los anticuerpos monoclonales, que se originan a partir de una única célula B, se han aplicado ampliamente en inmunoensayos, diagnósticos in vitro y desarrollo de fármacos. El nanocuerpo es un nuevo tipo de anticuerpo compuesto íntegramente por el dominio variable de un anticuerpo de cadena pesada. En comparación con los anticuerpos convencionales, estos nanocuerpos pequeños y estables pueden expresarse y funcionar en células vivas. Además, pueden acceder fácilmente a surcos, costuras o epítopos antigénicos ocultos en la superficie del objetivo. Esta revisión proporciona una descripción general de varios FP, el progreso de la investigación de sus anticuerpos, particularmente nanocuerpos, y aplicaciones avanzadas de nanocuerpos dirigidos a FP. Esta revisión será útil para futuras investigaciones sobre nanocuerpos dirigidos a FP, haciendo que los FP sean más valiosos en la investigación biológica.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Palabras clave: proteína fluorescente; anticuerpo monoclonal; nanocuerpo; progreso de la investigación; solicitud

1. Introducción

La proteína fluorescente (FP) es la proteína herramienta más utilizada en la investigación de las ciencias biomédicas. Tras el mayor uso de PF, también se han desarrollado anticuerpos contra PF. En comparación con el anticuerpo tradicional (Figura 1A), los anticuerpos de cadena pesada (HCAb) de camélidos (Figura 1B) y los receptores de nuevos antígenos de inmunoglobulina (IgNAR) de tiburones (Figura 1C) carecen naturalmente de cadenas ligeras. El anticuerpo de dominio único (sdAb) es un anticuerpo compuesto enteramente por dominios variables de HCAb o IgNAR. Su peso molecular es de 12 a 15 kDa, que es aproximadamente 1/10 del tamaño de un anticuerpo monoclonal; por lo tanto, también se le conoce como nanocuerpo. El nanocuerpo, con un tamaño más pequeño, alta estabilidad contra el ácido y el calor, fuerte capacidad de penetración, facilidad de ingeniería y expresión genética y alta afinidad, ha sido aplicado en diversos campos por investigadores científicos. Puede acceder fácilmente a surcos, costuras o epítopos antigénicos ocultos en la superficie del objetivo, reconociendo muchos antígenos que los anticuerpos convencionales no pueden reconocer [1]. Por lo tanto, los nanocuerpos se han utilizado como biomoléculas en organismos y sistemas de cultivo celular en biología del desarrollo, chaperonas cristalinas para el estado conformacional en biología estable, reguladores o inhibidores de la actividad enzimática, reactivos inmunohistoquímicos para análisis bioquímicos y anticuerpos secundarios en inmunotransferencia e inmunofluorescencia. –6]. Los nanocuerpos que se unen específicamente a FP se utilizan ampliamente en localización subcelular, estudios de vías de señalización intracelular, imágenes de células vivas y nanomateriales específicos [7–9]. En particular, los nanocuerpos tienen ventajas únicas sobre los anticuerpos IgG tradicionales en imágenes de súper alta resolución.

Figura 1. Diagramas de estructura de IgG (A), HCAb de camélido (B) e IgNAR de tiburón (C). VH, la región variable de la cadena pesada; VL, la región variable de la cadena ligera; CH/C, la región constante de la cadena pesada; CL, la región constante de la cadena ligera; VHH, el dominio variable de HCAb; VNAR, el dominio variable de IgNAR.

2. Descripción general de las proteínas fluorescentes

2.1. El descubrimiento de las proteínas fluorescentes

La luminiscencia es un fenómeno común en los invertebrados marinos. Los celentéreos, incluidas las medusas, la hidra y el coral, emiten fluorescencia verde bajo luz ultravioleta (UV) o azul, mientras que los ctenóforos emiten fluorescencia azul. La proteína verde fluorescente (GFP) fue identificada por primera vez en Aequorea victoria por Shimomura et al. en 1962 [10], y luego clonado y expresado en 1985 [11]. En consecuencia, las propiedades únicas y la estructura estable de la GFP de tipo salvaje (wtGFP) han atraído a muchos investigadores a estudiarla. Desde entonces, basándose en el conocimiento existente y su estructura cristalina, Tisen y sus colegas generaron varias proteínas GFP con diferentes propiedades fluorescentes mediante mutación y elaboraron el mecanismo de luminiscencia de GFP [12]. En cuanto a la investigación relacionada con la GFP, tres científicos (Shimomura, Chalfie y Tsien) ganaron el Premio Nobel de Química de 2008 por descubrir la GFP y sus destacadas contribuciones a su aplicación.

La proteína fluorescente roja ancestral (RFP), concretamente DsRed, fue clonada a partir de corales de arrecife no bioluminiscentes en 1999 [13]. RFP se puede utilizar junto con GFP para resolver problemas científicos que GFP por sí solo no puede resolver. Lo más importante es que, debido a la baja experiencia de RFP en imágenes intracelulares, es más adecuado para aplicaciones en investigación en biociencias [14,15]. Gracias a los esfuerzos de muchos científicos, se ha informado que los espectros de fluorescencia de los FP cubren toda la región visible e incluso la región del infrarrojo cercano, proporcionando una gran cantidad de herramientas para visualizar y cuantificar proteínas en células vivas [16]. La Figura 2 resume el desarrollo de los PF.

Figura 2. El desarrollo de proteínas fluorescentes. GFP, proteína verde fluorescente; BFP, proteína fluorescente azul; EGFP, proteína fluorescente verde mejorada; YFP, proteína fluorescente amarilla; RFP, proteína fluorescente roja; VHH, dominio variable de cadena pesada; VNAR, nuevo receptor de antígeno variable. El marcador verde pálido indica el progreso de la investigación sobre la aplicación de GFP y el marcador verde amarillo indica el progreso de la investigación sobre el anticuerpo GFP.

2.2. Estructura y propiedades funcionales de GFP.

La GFP es una FP ácida, globular y soluble de origen natural. La estructura primaria de GFP consiste en un monómero compuesto por 238 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 27 a 30 kDa. Su estructura cristalina muestra un centro formado por 11 cadenas antiparalelas, formando una estructura cilíndrica en forma de barril muy compacta. El centro del barril está protegido por un grupo emisor de luz de 4-(p-hidroxibencilideno)-5-imidazolinona conectado a su hélice, con ambos extremos sellados por segmentos de hélice cortos [17,18]. La maduración del cromóforo no requiere otro cofactor que el O2 [19]. GFP absorbe luz azul o luz ultravioleta y emite fluorescencia verde, con el pico de excitación principal a 395 nm, el pico de excitación más bajo a 475 nm y el pico de emisión a 509 nm. GFP es extremadamente estable y puede soportar fácilmente tratamientos a altas temperaturas. La fijación con formaldehído o la inclusión en parafina no afecta sus características de fluorescencia. A través de la investigación en profundidad de la estructura y el proceso de maduración de los PF, cada vez más investigadores rediseñan la estructura de los PF para dotarlos de nuevas funciones y propiedades, promoviendo aún más su desarrollo y aplicación.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

2.3. Derivados GFP

Los factores limitantes en las aplicaciones de GFP son el pH, la sensibilidad a los iones cloruro y la mala fotoestabilidad. Las modificaciones específicas de GFP corrigen estos defectos, aumentando su rendimiento cuántico, brillo, coeficiente de extinción molar y fotoestabilidad. Además, se han establecido varios derivados de GFP para ampliar la gama de colores emitidos, incluidos el azul, el ultramar, el cian y el amarillo.

En respuesta a la baja intensidad de fluorescencia de wtGFP bajo excitación con luz azul y su expresión inestable en células de mamíferos, Zhang et al. diseñaron una sustitución de aminoácidos de GFP (F64L y S65T), a saber, GFP mejorada (EGFP), cuya intensidad de fluorescencia aumenta 35- veces [20]. EGFP sigue siendo el mutante de FP más utilizado en la región de luz verde, dada su buena fotoestabilidad y alto brillo. Además, se han optimizado las propiedades de plegado de GFP, obteniendo una súper plegadora GFP (sfGFP) con súper capacidad de plegado. El sfGFP tiene seis mutaciones nuevas, incluidas S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V y A206V. sfGFP puede plegarse eficientemente incluso cuando se expresa en fusión con proteínas insolubles, asegurando el brillo de su fluorescencia [21]. GFPuv, otra forma modificada de GFP, está optimizada para la fluorescencia bajo luz ultravioleta. Genera una fluorescencia verde más brillante en presencia de luz ultravioleta con un pico de excitación a 395 nm y un pico de emisión a 509 nm y puede utilizarse para señalar la ubicación de diferentes proteínas intracelulares [22,23]. En GFPuv se producen tres sustituciones de aminoácidos, incluidos F99S, M153T y V163A. Estas mutaciones inducen una expresión 18- veces más fuerte de GFPuv que wtGFP en E. coli. El gen GFPuv es un gen sintético en el que los cinco codones Arg de baja frecuencia se reemplazan por codones adecuados para E. coli para garantizar la expresión eficaz de GFPuv.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Haga clic aquí para ver los productos Cistanche Enhance Immunity

【Pregunte por más】 Correo electrónico:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

La mutación dirigida al sitio de Y66H construye la proteína fluorescente azul (BFP) con un pico de excitación a 384 nm y un pico de emisión a ~445 nm. Su espectro de excitación es cercano al de la luz ultravioleta, que daña las células durante el funcionamiento, y su corta longitud de onda de emisión induce autofluorescencia en las células. La BFP mejorada (EBFP) es débilmente luminiscente y poco resistente al fotoblanqueo y al ácido, con una señal de fondo alta para imágenes celulares. Se han desarrollado tres mutantes de EBFP más brillantes, incluidos Azurite [24], EBFP2 [25] y mTagBFP [26], que son 1.6-, 2.0- y 3.{{13} } veces más brillante que EBFP, respectivamente. mTagBFP, la BFP más brillante, se deriva de un mutante de la proteína fluorescente roja (RFP) TagRFP [27], con un coeficiente de extinción de 52,000 M−1 cm−1 y un rendimiento cuántico de {{19 }}.63, lo que mejora significativamente su resistencia al fotoblanqueo. La mutación de Y66F en wtGFP da como resultado una proteína fluorescente ultramarina con una longitud de onda de emisión de 442 nm [28]. Sin embargo, el bajo rendimiento cuántico de fluorescencia de la variante GFP-Y66F limita gravemente su aplicabilidad en la obtención de imágenes. Una mayor mutación de GFP-Y66F con sustituciones de aminoácidos de T65Q, Y145G, H148S y T203V da como resultado la proteína fluorescente ultramarina Sirius, que es 25 veces más brillante que GFP-Y66F [29].

La proteína fluorescente cian (CFP) tiene un pico de excitación a 449 nm y un pico de emisión a ~482 nm, con propiedades espectrales que oscilan entre BFP y EGFP. De manera similar a BFP, se utiliza una mutación dirigida al sitio de Y66W para construir CFP. La CFP tiene amplias aplicaciones en la investigación de localización y imágenes multicolores debido a su excelente fotoestabilidad. Por ejemplo, el gen que codifica CFP se ha optimizado para la preferencia de codones humanos y ahora está disponible comercialmente con el nombre comercial AmCyan1 (Clontech). Además, existen varios mutantes más brillantes que la CFP mejorada (ECFP), como Cerulean, mTFP (dos veces más brillante que Cerulean) y turquesa (aproximadamente dos veces más brillante que ECFP) [21,30].

Las mutaciones en la proteína fluorescente amarilla (YFP) no están restringidas en el motivo central del cromóforo Y66 sino en residuos estructuralmente adyacentes a Y66. El pico de excitación de YFP es de ~518 nm, con un pico de emisión de ~531 nm. En comparación con GFP, la fluorescencia de YFP se desplaza hacia el espectro rojo, lo que se debe principalmente a la sustitución de Thr por Tyr en la posición 203. El YFP mejorado (EYFP) es uno de los biosensores de FP más fluorescentes y ampliamente utilizados para detectar el pH intracelular y concentraciones de iones cloruro. Sin embargo, es muy susceptible a los iones de ácido y cloruro y es menos fotoestable que muchos PF derivados de medusas [31]. mCitrine y mVenus, versiones mejoradas de EYFP, son actualmente los YFP más utilizados [32,33]. Las propiedades fotofísicas de GFP y sus derivados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Propiedades fotofísicas de GFP, RFP y sus derivados.

Tabla 1. Cont.

2.4. Derivados RFP

RFP es otro FP ampliamente utilizado. DsRed es un tetrámero que tiende a formar multímeros al realizar fusiones de proteínas y puede resultar tóxico cuando se expresa intracelularmente, por lo que ha sido diseñado para obtener monómeros. La RFP más notable es la familia "mFruit", que incluye mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine y mStrawberry (Tabla 1), de las cuales mCherry, con mutaciones de K163Q y K83L, es la más preferida. mCherry tiene una maduración rápida, buenas propiedades monoméricas y mejor fotoestabilidad, aunque es menos brillante [34]. Sin embargo, TagRFP en su forma monomérica es aproximadamente de tres a cuatro veces más brillante que mCherry, lo que lo convierte en un RFP monomérico relativamente brillante que está disponible actualmente [27]. mKate es una nueva proteína monomérica fluorescente de color rojo lejano derivada de una mutación de cuatro sitios de TagRFP con un pico de excitación a 588 nm y un pico de emisión a 635 nm, que es solo un 45 % más brillante que EGFP; su proteína de dimerización, Katushka, es un 67% más brillante que EGFP [35]. mKate2, un mutante de mKate con sustituciones de aminoácidos de V38A, S165A y K238R, tiene aproximadamente el doble de brillo que mKate [36]. En comparación con GFP y RFP, mKate y Katushka exhiben una mejor profundidad de imagen y señales ópticas más ricas para imágenes de fluorescencia intraobjeto [35]. Por lo tanto, el desarrollo de proteínas fluorescentes de color rojo lejano es más valioso para la bioimagen in vivo.

2.5. FP de infrarrojo cercano

Los FP de infrarrojo cercano (NIR) son muy deseados como etiquetas de proteínas en aplicaciones de imágenes. La mayoría de los FP NIR están diseñados a partir de fotorreceptores de fitocromo bacterianos (BphP) [37]. El primer NIR FP utilizado en imágenes de animales vivos es IFP1.4, una proteína fluorescente derivada de BphP que emite fluorescencia al unirse a un cromóforo de biliverdina (BV) [38]. Mediante mezcla de ADN y mutagénesis aleatoria, se desarrolla un IFP2.0 más brillante [39]. Aunque IFP1.4 e IFP2.0 monoméricos se pueden lograr rompiendo la interfaz de dimerización de BphP, todavía tienden a dimerizarse en altas concentraciones. En 2015 se diseñó una proteína fluorescente infrarroja (IFP) monomérica natural, mIFP. Se ha demostrado que mIFP tiene efectos de imágenes de sonido en larvas y neuronas de Drosophila. Shcherbakova et al. diseñó tres FP NIR monoméricos brillantes con espectros distintos, a saber, miRFP670, miRFP703 y miRFP709 [41]. Los FP NIR derivados de BphP requieren como mínimo dos dominios, PAS (Per-ARNT-Sim) y GAF (cGMP fosfodiesterasa-adenilato ciclasa-FhlA), para unir covalentemente un cromóforo BV y también poseen una estructura compleja de "nudo en forma de ocho". uniendo topológicamente los dominios GAF y PAS, lo que afecta su plegamiento. Por lo tanto, se utiliza otra clase de fotorreceptores bacterianos, las aloficocianinas (APC), para diseñar FP NIR, como smURFP [42]. Aunque los FP NIR basados ​​en APC son más pequeños, se unen a BV de manera menos eficiente, lo que lleva a un brillo significativamente menor en células de mamíferos que los FP NIR derivados de BphP. Para superar los defectos de los FP NIR basados ​​en BphP y APC, se desarrolló un FP NIR de dominio único llamado miRFP670nano a partir de cianobacteriocromo (CBCR), que representa el primer FP NIR derivado de CBCR que puede unirse eficientemente al cromóforo BV endógeno y emitir fluorescencia brillante en células de mamíferos [43]. Una ventaja esencial de miRFP670nano sobre los FP NIR derivados de BphP es su alta fotoestabilidad. El miRFP670nano3 mejorado, con 14 mutaciones relativas al miRFP670nano parental, exhibe una fotoestabilidad similar a la del miRFP670nano [44]. La Tabla 2 resume las propiedades fotofísicas de los FP NIR.

Tabla 2. Propiedades fotofísicas de los FP NIR.

El descubrimiento y la aplicación de los FP han proporcionado una poderosa herramienta de investigación para la biología moderna. Hoy en día, los PF se han convertido en una de las herramientas comunes que utilizan los científicos para extender sus aplicaciones a muchas áreas de investigación, como la regulación de la expresión genética, el etiquetado de orgánulos, la transmisión de señales, la detección de fármacos y las interacciones biomoleculares. La mayoría de los vectores de clonación que expresan FP se han comercializado y están disponibles a través de empresas comerciales.

3. Avanza la investigación sobre anticuerpos proteicos fluorescentes

3.1. Anticuerpo monoclonal dirigido a proteínas fluorescentes

El anticuerpo es un tipo de inmunoglobulina secretada por los linfocitos B. Los anticuerpos monoclonales constan de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, la cadena pesada consta de una región variable (VH) y tres regiones constantes (CH), y la cadena ligera consta de una región variable (VL) y una región constante (CL). ). Las cadenas pesadas están unidas covalentemente mediante enlaces disulfuro y la región CL de la cadena ligera está unida de forma no covalente al dominio CH1 de la cadena pesada para formar una molécula de anticuerpo estable [45]. Debido a su capacidad de unión específica al receptor, los anticuerpos monoclonales producen una variedad de actividades biológicas, como el bloqueo clásico, la neutralización, la activación del complemento, la destrucción de células diana a través del receptor Fc y la regulación de la actividad inmune. Son macromoléculas biológicas críticas ampliamente aplicadas en inmunoensayos, diagnósticos in vitro y desarrollo de fármacos. Los anticuerpos policlonales son una mezcla de anticuerpos heterotípicos derivados del proceso de respuesta inmune de múltiples células B, y cada anticuerpo reconoce un epítopo diferente del mismo antígeno [45]. En comparación con los anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales detectan específicamente un epítopo en el antígeno y es menos probable que reaccionen de forma cruzada con otras proteínas, lo que produce señales de tinción de fondo bajas. Además, la reproducibilidad de los resultados de los anticuerpos monoclonales es mayor que la de los anticuerpos policlonales en las mismas condiciones experimentales.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90%) se purifica mediante una 2-técnica de pasos sencilla que utiliza mAb FMU-GFP.5-resina de Sefarosa 4B acoplada. Además, todas las proteínas diana recombinantes funcionales acopladas a GFP pueden aislarse fácil y directamente de las células, gracias al epítopo de GFP. Estos datos sugieren que este método es más eficaz para purificar GFP que cualquier método disponible y resuelve el desafío de bajo rendimiento y pureza en la mayoría de los métodos de purificación de GFP.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

3.2. Nanocuerpo dirigido a proteínas fluorescentes

3.2.1. Introducción del nanocuerpo

Las propiedades inherentes de los anticuerpos monoclonales, como su gran peso molecular, su estructura compleja y su actividad biológica limitada, han restringido cada vez más sus aplicaciones futuras. Por tanto, es urgente desarrollar alternativas a los anticuerpos monoclonales. En 1989, Ward et al. preparó un dominio variable de anticuerpo de cadena pesada únicamente con capacidad de unión débil hacia la lisozima, lo que despertó el interés en la investigación de sdAb [48]. En 1993, Hamers Casterman et al. Descubrieron por primera vez un nuevo tipo de anticuerpo en suero de camello, que es completamente diferente del anticuerpo tradicional de mamífero [49]. Este tipo de anticuerpo se denomina HCAb debido a su falta natural de cadenas ligeras. HCAb consta de CH2, CH3, la región bisagra y el dominio variable de HCAb (VHH), pero aún tiene plena capacidad de unión a antígeno. En 1995, Greenberg et al. descubrieron anticuerpos exclusivos de cadena pesada, conocidos como IgNAR, en tiburones nodriza [50]. Existe tanto en forma secretora como unida a membrana, y consta de una región variable, denominada receptor de nuevo antígeno variable (VNAR), y varias regiones constantes. Posteriormente, se ha encontrado IgNAR en el tiburón wobbegong, la mielga, el tiburón cuerno y el tiburón bambú de manchas blancas, complementando los repertorios de sdAbs. Un nanocuerpo posee las características de peso molecular pequeño, alta afinidad, gran estabilidad, buena solubilidad, fuerte penetración en los tejidos y reconocimiento de epítopos de antígenos ocultos. Ha atraído una mayor atención en el diagnóstico de enfermedades, reactivos inmunológicos, detección de patógenos y desarrollo de fármacos [51]. Con el desarrollo de técnicas de biología molecular y la mejora de la tecnología de preparación de anticuerpos genéticamente modificados, los nanocuerpos se han convertido en un campo de investigación popular en inmunoensayo. La Figura 3 resume el desarrollo del nanocuerpo hasta la fecha.

Figura 3. El desarrollo del nanocuerpo. El marcador azul claro indica el progreso de la investigación sobre medicamentos con nanocuerpos. FDA, Administración de Alimentos y Medicamentos; EMA, Agencia Europea de Medicamentos; NMPA, Administración Nacional de Productos Médicos; HCAb, anticuerpo de cadena pesada; IgNAR, nuevos receptores de antígenos de Ig; sdAb, anticuerpo de dominio único; VHH, dominio variable de HCAb; VNAR, dominio variable de IgNAR; PD-L1, ligando 1 de muerte celular programada 1.

3.2.2. Nanocuerpo dirigido a proteínas fluorescentes

Las proteínas fluorescentes han cambiado la biología y la bioquímica celular al ofrecer marcadores de proteínas fluorescentes codificados por genes fáciles de usar. Se han desarrollado varios agentes de unión estrecha para objetivos de investigación y fármacos mediante la síntesis y selección de bibliotecas de andamios de proteínas durante el desarrollo paralelo [52]. Un ejemplo es el desarrollo de nanocuerpos, que son más fáciles de seleccionar con mayor estabilidad, solubilidad y rendimiento [53]. A diferencia de los anticuerpos tradicionales, estos nanocuerpos pequeños y estables son funcionales en las células vivas. Por lo tanto, el nanocuerpo con actividad de unión específica a FP es una potente herramienta para la fusión, separación e ingeniería celular de FP en diversas áreas de la investigación biológica.

• Nanocuerpos derivados de camélidos dirigidos a GFP

Se han fusionado varias proteínas con excelentes características de localización subcelular a GFP, creando antígenos visuales para detectar proteínas directamente en varios compartimentos subcelulares. En 2006, Rothbauer et al. examinaron un fragmento de anticuerpo específico de GFP (cAbGFP4) inmunizando alpaca con GFP [54]. El ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR) de la interacción entre cAbGFP4 y el antígeno GFP mostró una alta afinidad (KD=0.23 nM). Además, el nanocuerpo anti-GFP se combinó con un RFP monomérico, produciendo el anticuerpo visible de unión a GFP empleado para examinar la distribución del nanocuerpo anti-GFP en células vivas. Mediante filtración en gel, inmunotransferencia y ensayos de microscopía confocal, se demostró que el nanocuerpo específico de GFP se distribuye de manera estable en células de mamíferos sin degradación o agregación de proteínas detectable que se encuentra comúnmente en fragmentos variables de cadena sencilla. Además, Kubala et al. caracterizó el complejo GFP:cAbGFP4 (Figura 4A) mediante cristalografía de rayos X y calorimetría de titulación isotérmica (ITC) [55], revelando la base de la alta afinidad y especificidad de los nanocuerpos en la unión a proteínas. En 2020, se identificaron cuatro nanocuerpos anti-GFP distintos, denominados A12, B9, D5 y E6, mediante presentación en fagos [56]. Los ensayos de PAGE nativo y de inmunoprecipitación revelaron que estos nanocuerpos podrían unirse a GFP in vitro e in vivo.

Figura 4. Diagrama del complejo GFP-nanocuerpo. (A) cAbGFP4 (PDB:3OGO, naranja); (B) GBP1 (PDB: 3K1K, azul claro); (C) GBP4 (PDB: 3G9A, rosa); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, amarillo); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, magenta). (F) Superposición estructural de los nanocuerpos anteriores con el complejo GFP. GFP se muestra en color verde.

La conformación de las proteínas está estrechamente relacionada con la función y suele estar controlada por factores reguladores. Axel et al. identificó siete aglutinantes específicos de GFP, a saber, proteínas de unión a GFP (GBP) 1–7 [57]. Entre ellos, GBP1 aumentó la fluorescencia de GFP 10- veces, mientras que GBP4 indujo una disminución de 5- veces la fluorescencia de GFP; por lo tanto, se los denominó "potenciadores" y "minimizadores", respectivamente. Los análisis estructurales del complejo GFP-nanocuerpo (Figura 4B, C) revelaron que los dos nanocuerpos causaron modestos cambios opuestos en el medio del cromóforo, alterando sus características de absorción [58]. Además, se identificaron 25 nanocuerpos (LaG) específicos de GFP, con valores de KD que oscilaban entre 0.5 nM y más de 20 µM [59]. Un nanocuerpo bivalente (LaG-16-LaG-2) mostró la mayor afinidad, con un valor KD de 36 pM. Además, la intensidad máxima de fluorescencia de GFP aumentó aproximadamente un 60% cuando se incubó con exceso de proteína LaG. Zhang et al. informaron la estructura cristalina de GFPuv complejada con LaG16 (Figura 4D) con una resolución de 1,67 Å [60]. El sitio de unión de LaG16 en el barril de GFP estaba ubicado en el otro lado del potenciador de GFP. Por lo tanto, LaG16 y el potenciador de GFP se fusionaron con un conector (GS)4. El nanocuerpo bivalente tenía una afinidad de 0,5 nM, lo que demuestra la viabilidad de diseñar aglutinantes de proteínas objetivo de afinidad ultraalta mediante la dimerización de 2 nanocuerpos que se unen con diferentes epítopos.

En 2014, Twair et al. preparó sfGFP e inmunizó a un camello adulto de una joroba. Se aislaron siete nanocuerpos anti-sfGFP dirigidos a tres epítopos (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 y 08) [61]. Basados ​​en ELISA y ensayos de inmunotransferencia, estos nanocuerpos reconocieron sfGFP etiquetado como libre o fusionado con la hormona del crecimiento. Además, la estructura cristalina del nanocuerpo NbsfGFP02 complejado con sfGFP (Figura 4E) se estableció con una resolución de 2,2 Å. Se determinó que la afinidad entre NbsfGFP02 y sfGFP era de 15,8 nM mediante interferometría de biocapa (BLI). La temperatura de fusión fue de 75,6 grados para NbsfGFP02 [62]; por lo tanto, es un posible candidato a nanocuerpo GFP en aplicaciones que exigen condiciones de prueba duras. La mayoría de los nanocuerpos pueden expresarse funcionalmente in vivo mediante transfección de plásmidos en células eucariotas. Por tanto, los nanocuerpos son una excelente herramienta para identificar características estructurales o dinámicas en células vivas. En 2020, Zhou et al. propusieron un método novedoso para expresar los nanocuerpos de unión a GFP construidos (cAbGFP4) como ARNm de transcripción in vitro (IVT), denominado nanocuerpo-mCherry [63]. El ARNm con regiones no traducidas y análogos de tapa inversa cubiertos con nucleótidos modificados químicamente y cola poli(A) se preparó in vitro y se usó para la transfección. A diferencia del nanocuerpo expresado utilizando el ADN plasmídico, el nanocuerpo anti-GFP expresado utilizando el ARNm de IVT se identificó dentro de las 3 h posteriores a la transfección y se degradó dentro de las 48 h. Por lo tanto, expresar el ARNm codificado del nanocuerpo en células vivas permite la entrega eficiente del nanocuerpo.

• Nanocuerpos derivados de tiburones dirigidos a GFP.

Wei y col. demostraron que los tiburones bambú producían una respuesta inmune eficaz contra la inmunización con GFP, caracterizada por recuentos elevados de linfocitos e IgNAR específicos de antígeno [64]. En total, se aislaron 7 nanocuerpos anti-GFP, incluidos BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 y 105, con una afinidad de hasta 0,3 nM, de tiburones bambú inmunizados, lo que implica que los tiburones bambú fabricar IgNAR de alta afinidad. Además, se construyeron los VNAR biparatópicos con mayor afinidad por GFP (20,7 pM) y se validó el carácter de los nanocuerpos anti-GFP como intracuerpos en células de mamíferos. Estos hallazgos acelerarán la investigación y el progreso de los sdAb de tiburón bambú para proporcionar nanocuerpos de bajo costo y fáciles de usar para la industria biomédica.

• Nanocuerpos dirigidos a otras proteínas fluorescentes.

Masabi es una proteína fluorescente verde monomérica brillante. Li y col. construyó con éxito una biblioteca de anticuerpos de 4 × 107 transformantes inmunizando camellos con mWasabi como antígeno y cribó 3 nanocuerpos específicos de mWasabi de alta afinidad, denominados Nb4, Nb6 y Nb27 [65]. Estos nanocuerpos reconocieron el wasabi solo o en combinación con la muerte programada 1 (PD-1). En total, se identificaron 6 nanocuerpos (LaM) dirigidos a mCherry con alta especificidad, con valores de KD que oscilan entre 0,18 nM y 63 nM [59]. Además, se aislaron tres nanocuerpos específicos de iRFP713- (BSR1, BSR3 y BSR4) con afinidades de unión nanomolares [64]. Estos datos sugieren que la inmunización de los tiburones bambú puede producir nanocuerpos de alta afinidad. En general, la capacidad de los nanocuerpos para unirse a proteínas celulares y atraer proteínas de fusión FP permite un control preciso de los procesos y estructuras celulares en las células vivas. Esta nanotrampa FP multifuncional permite análisis microscópicos, bioquímicos y funcionales con una combinación única de la misma proteína. Los nanocuerpos dirigidos a FP se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Resumen de nanocuerpos dirigidos a FP.

4. Aplicaciones del nanocuerpo de proteína fluorescente

4.1. Aplicaciones en la detección de proteínas

4.1.1. Detección de proteínas intracelulares

Comprender la función de las proteínas requiere una localización de proteínas de alta resolución confiable y cuantificable. Aunque el uso de anticuerpos para marcar proteínas diana está bien establecido en biología molecular, esta técnica está limitada por el tamaño y la multivalencia de los anticuerpos convencionales. Dado el pequeño tamaño de los nanocuerpos, pueden usarse como trazadores para imágenes intracelulares después de la ligación con moléculas fluorescentes, enzimas, péptidos, receptores, biotina y otros fármacos. Por ejemplo, se utilizaron nanocuerpos contra FP en imágenes de microscopía de superresolución cuando se marcaron con tintes orgánicos [66,67]. Se tomaron imágenes de células Ptk2 que expresan continuamente tubulina YFP utilizando este enfoque y la resolución se mejoró a 269 ± 37 Å, en comparación con aproximadamente 450 Å con los anticuerpos convencionales.

El etiquetado mediado por nanocuerpos ofrece un método rápido y versátil para etiquetar casi cualquier estructura de fusión derivada de FP comúnmente accesible para obtener imágenes sofisticadas de microscopía de localización de molécula única SMLM. Específicamente, SMLM de dos colores puede investigar la localización subcelular de cualquier construcción funcional de fusión de GFP y RFP cuando se usan nanocuerpos contra GFP y RFP simultáneamente [68]. Por lo tanto, numerosos problemas biológicos pueden abordarse rápidamente utilizando imágenes SMLM de dos colores. Ariotti et al. propusieron un enfoque modular para el etiquetado de proteínas basado en enzimas, lo que permite mejorar la velocidad y el muestreo para analizar las distribuciones de proteínas subcelulares con resolución EM [7]. Al diseñar GBP4 directamente en la etiqueta de ascorbato peroxidasa de soja modificada (APEX), se demostró que APEX podría dirigirse a cualquier proteína de interés marcada con GFP. La fusión APEX-GBP4 proporciona una notable localización de proteínas de alta resolución en los subdominios de orgánulos y acorta significativamente el tiempo para caracterizar las distribuciones de proteínas subcelulares. Además, permite la resolución EM de proteínas marcadas con GFP expresadas a niveles endógenos.

Se generó una caja de herramientas de plásmidos que codifican nanocuerpos específicos de FP y se fusionaron en módulos funcionales. Esta caja de herramientas permite la visualización y manipulación de vías de señalización intracelular en células vivas, ampliando significativamente sus usos in vivo [9]. Estos incluyen sensores fluorescentes para la visualización dinámica de Ca2+, H+ y ATP/ADP, y módulos oligoméricos o heterodiméricos que permiten el reclutamiento o aislamiento de proteínas y el reconocimiento de sitios de contacto de membrana entre orgánulos. En 2017, Herce et al. utilizó péptido de penetración celular (CPP) para transportar anticuerpos directamente a las células para el inmunomarcaje y la manipulación de antígenos [69]. Se construyó un sistema que aprovechó la alta afinidad del CPP cíclico rico en arginina hacia el ARN en el nucléolo. Al vincular el CPP cíclico rico en arginina al nanocuerpo GFP, la relocalización de GFP en el nucléolo se puede observar directamente en las células (Figura 5A). Por lo tanto, este sistema visualizado se puede utilizar para rastrear la ubicación de la proteína y comparar cuantitativamente la eficiencia de diferentes CPP.

La técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se utiliza ampliamente en la investigación de ciencias biológicas porque permite la detección dinámica en tiempo real de moléculas de señalización en condiciones fisiológicas en células vivas. Debido a su sensibilidad y especificidad excepcionales, el análisis basado en la transferencia de energía por resonancia de Förster (TR-FRET) resuelta en el tiempo se está volviendo cada vez más popular en la investigación biomédica. El método TR-FRET basado en nanocuerpos permite una fácil cuantificación de proteínas fluorescentes (de fusión) en lisados ​​con una sensibilidad mucho mayor que las lecturas de intensidad de fluorescencia convencionales [70].

Figura 5. Aplicaciones del nanocuerpo de proteína fluorescente. (A) Visualización de interacciones proteína-proteína. El nanocuerpo anti-GFP (Nb) unido a péptidos penetrantes en las células (CPP) puede penetrar el núcleo celular. Si la proteína marcada con GFP no interactúa con la proteína marcada con RFP, solo la proteína marcada con GFP se relocaliza en el nucléolo a través de Nb-CPP, mostrando un color verde. Sin embargo, si las dos proteínas interactúan, ambas proteínas se relocalizan en el nucléolo y muestran un color amarillo. (B) El nanocuerpo GFP permite el etiquetado selectivo de proteínas de vesículas recién exocitadas. Paso 1: La proteína de la vesícula se acopla a GFP y se incuba con un nanocuerpo no fluorescente (NbGFP), lo que resulta en la inaccesibilidad de GFP con el nanocuerpo de unión a fluorescencia (NbGFP*). Pasos 2 y 3: después de la estimulación de la exocitosis celular, la nueva proteína de la vesícula se expone a la membrana plasmática y puede marcarse con NbGFP*. (C) Ilustración esquemática de degradado. La degradación selectiva de proteínas se logra mediante la vía de la ubiquitina, que se lleva a cabo mediante una serie compleja de enzimas. La proteína F-box (FBP) en los complejos de proteína ligasa (SCF) SKP1-CUL1-F-box se fusiona con el nanocuerpo anti-GFP (Nb) para reconocer la proteína de fusión GFP, y la enzima conjugadora de ubiquitina (E2) une covalentemente múltiples moléculas de ubiquitina a la proteína objetivo. Posteriormente, la proteína poliubiquitinada es degradada por el proteosoma. (D) Descripción esquemática de BiCAP. La proteína HER está fusionada a fragmentos N-terminales (GFP1) o C-terminales (GFP2) de GFP. Cuando las dos fusiones forman un dímero, la GFP se repliega y emite fluorescencia. Luego, el dímero HER y las proteínas que interactúan se enriquecen utilizando un nanocuerpo de GFP, que no tiene capacidad de unión hacia los fragmentos de GFP y, por lo tanto, permite el aislamiento del dímero. (E) Sistema de transcripción dependiente de GFP. El dominio de unión al ADN (DBD) y el dominio de activación (AD) están fusionados con el nanocuerpo 1 de GFP (Nb1) y el nanocuerpo 2 de GFP (Nb2), respectivamente. En presencia de GFP, DBD-Nb1 y AD-Nb2 pueden activar el gen indicador de la secuencia activadora aguas arriba (UAS), lo que conduce a la regulación positiva de los genes diana. (F) Reconocimiento de proteínas marcadas con GFP en nanoestructuras de ADN. Las nanoestructuras de ADN con dos sitios de unión se ligan a la resina magnética, se unen al nanocuerpo de GFP (Nb) mediante emparejamiento de bases complementarias y luego se incuban con proteínas marcadas con GFP. Por lo tanto, las proteínas marcadas con GFP pueden unirse con precisión a las nanoestructuras.

Figura 5. Continuación.

4.1.2. Detección de proteínas en la superficie celular

La visualización de la superficie bacteriana es una tecnología prometedora para producir proteínas ancladas a células y diseñar catalizadores de células completas. Aunque se utilizan varias proteínas de la membrana externa para la visualización en superficie, no se dispone de métodos simples, universales y compatibles de alto rendimiento para evaluar y desarrollar sistemas de visualización en superficie. Además, es un desafío distinguir entre proteínas intracelulares y de superficie. Wendel et al. construyó un sistema de detección de visualización de superficie basado en fluorescencia fusionando nanocuerpos GFP con anclajes de membrana externos [71]. Se eligieron como anclajes dos proteínas de la membrana externa de uso común: la proteína A de la membrana externa (OmpA) y el autotransportador (C-IgAP). Por lo tanto, se construyen dos módulos de visualización diferentes fusionando OmpA o C-IgAP con nanocuerpos específicos de GFP, visualizados agregando GFP purificada externamente. Aunque la propia GFP se puede mostrar en la superficie celular, este nuevo método evita el problema de los falsos positivos ya que sólo si la GFP se une al nanocuerpo presentado en la superficie celular las células pueden producir una señal fluorescente. El ensayo es compatible con muchos métodos de detección de fluorescencia, incluida la detección de fluorescencia de células completas en placa, fluorescencia en gel, microscopía y citometría de flujo. Este método de visualización de superficies, económico y fácil de leer, ayudará a demostrar el mecanismo de transporte de proteínas a la superficie de las células vivas, lo que permitirá el desarrollo racional de sistemas de visualización de superficies bacterianas y biocatalizadores robustos de células enteras en el futuro.

La liberación de neurotransmisores requiere exocitosis, endocitosis y formación de nuevas vesículas de fusión. No se comprende bien qué sucede con las proteínas de las vesículas después de la exocitosis, cuando quedan en la membrana plasmática. Estas proteínas frecuentemente se conjugan con restos de GFP (flúor) sensibles al pH. Como las imágenes de pHluorina suelen estar limitadas por la difracción de manchas varias veces más grandes que las vesículas, es valioso utilizar nanocuerpos anti-GFP para marcar selectivamente las vesículas exocitadas [72]. Al vincular nanocuerpos anti-GFP a fluoróforos químicos adecuados para obtener imágenes de súper resolución, el tamaño y la intensidad de las proteínas marcadas con pHluorin en diversas condiciones se pueden detectar de maneras que no son posibles con pHluorin solo. Tras la estimulación de la exocitosis, se exponen nuevas proteínas vesiculares a la membrana plasmática y luego los nanocuerpos marcados con fluorescencia se unirán al pHluorin (Figura 5B). Por lo tanto, la detección de pHluorina basada en nanocuerpos es una herramienta prometedora para estudiar eventos postexocitosis en neuronas.

4.2. Aplicaciones en la degradación dirigida de moléculas de proteínas

En comparación con la edición de genes y la interferencia de ARN, la manipulación directa de biomoléculas a nivel de proteínas es una ruta más eficiente para los estudios de función de las proteínas, superando limitaciones como posibles efectos fuera del objetivo, inactivación de genes y pérdida de la función fenotípica de genes esenciales. La degradación dirigida de proteínas es actualmente una importante estrategia de investigación para lograr la pérdida de función y la proteólisis de proteínas de interés. Un degradador de proteínas basado en nanocuerpos puede ayudar a lograr una degradación rápida y una regulación reversible de las proteínas de interés. Caussinus et al. desarrolló un método de degradación de proteínas para el agotamiento directo y rápido de las proteínas de fusión GFP objetivo en cualquier sistema eucariótico [73]. Brevemente, para derribar la proteína de fusión GFP, se fusiona un nanocuerpo anti-GFP a la proteína F-box (FBP) en los complejos de ligasa E3 de la proteína F-box (SCF) SKP1-CUL1- para reconocer la proteína de fusión GFP. La enzima conjugadora de ubiquitina (E2) une covalentemente múltiples moléculas de ubiquitina a la proteína de fusión GFP objetivo. Posteriormente, el complejo SCF degrada la proteína poliubiquitinada; por lo tanto, la eliminación de la proteína objetivo es fácil de controlar (Figura 5C). Esta técnica, denominada degradación de proteína fluorescente verde (deGradFP), se ha utilizado para la degradación de GFP y sus fusiones en células de mamíferos, embriones de pez cebra [74] y plantas [75].

4.3. Aplicaciones en el sistema de purificación por afinidad de complementación bimolecular

En 2016, Croucher et al. desarrolló un sistema de purificación por afinidad de complementación bimolecular (BiCAP) que puede distinguir eficazmente el dímero (homólogo y heterólogo) del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) del monómero [76]. En este sistema, dos fragmentos complementarios de una molécula de FP se fusionan con dos proteínas HER (HER1, HER2 o HER3). Estos dos fragmentos no pueden ensamblarse espontáneamente en proteínas fluorescentes activas. Sin embargo, supongamos que las dos proteínas HER interactúan entre sí. En ese caso, los dos fragmentos estarán espacialmente cerca uno del otro y serán complementarios, reconstruyéndolos en una proteína fluorescente completa y activa (Figura 5D). El dímero HER y las proteínas que interactúan se pueden enriquecer utilizando un nanocuerpo de GFP, que no tenía afinidad por los fragmentos de GFP, lo que permite el aislamiento y el enriquecimiento del dímero. Al analizar las proteínas identificadas, se reveló que los tres dímeros (HER2:HER2, HER2:HER3 y HER1:HER2) tienen proteínas que interactúan en común y su interactoma específico. FAM59A, una proteína que interactúa específicamente con el dímero HER1:HER3, media la activación de la vía de la quinasa regulada por señales extracelulares, proporcionando un nuevo objetivo para la terapia del cáncer de mama.

planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico

4.4. Aplicaciones en otras áreas

El diagnóstico temprano in vitro de enfermedades y el seguimiento de los efectos terapéuticos es un problema importante en el diagnóstico de enfermedades. Un agente de contraste ideal debe tener buena penetración tisular, alta afinidad antigénica y capacidad de eliminación rápida con daño mínimo a los tejidos normales. Los nanocuerpos tienen el potencial como agentes de obtención de imágenes ideales que pueden atravesar los vasos sanguíneos y entrar en los tejidos para obtener mejores imágenes y aplicaciones terapéuticas.

Los FP no sólo iluminan las células y los procesos biológicos, sino que también constituyen excelentes andamios debido a su aparente falta de conexión con numerosas redes de proteínas del huésped. Utilizando GBP y GFP como andamio para impulsar la formación de complejos biológicamente activos, Tang et al. Creó una biblioteca de factores de transcripción híbridos que controlan exclusivamente la expresión génica en presencia de GFP y sus derivados [77]. La producción de GFP controla la expresión de genes específicos de células (Figura 5E) y promueve la disfunción de la retina y el cerebro del ratón. Además, los ratones transgénicos GFP y las cepas de pez cebra se modifican para lograr una transcripción dependiente de GFP para el seguimiento fotogenético de los circuitos neuronales. Este trabajo establece la posición de GFP como un andamio versátil y abre la puerta a la manipulación selectiva de varias células marcadas con GFP en cepas transgénicas. En base a esto, también se pueden desarrollar otros productos intracelulares como andamios específicos de células en organismos multicelulares.

Las nanoestructuras de ADN se han convertido en una herramienta esencial y eficaz para estudiar la actividad enzimática y la función de las proteínas. Sin embargo, es difícil desarrollar estrategias universales para formar complejos proteicos en nanoestructuras de ADN. Una de las dificultades es la unión de proteínas de interés a nanoestructuras de ADN. Sommese et al. propuso un enfoque novedoso para etiquetar nanoestructuras de ADN [78]. Al funcionalizarlos con un nanocuerpo GFP, la capacidad de unión de proteínas se puede controlar con precisión (Figura 5F). En comparación con los aptámeros de ADN específicos de GFP, los nanocuerpos exhiben una mayor especificidad, estabilidad y afinidad hacia GFP. Por lo tanto, la aplicación de nanoestructuras de ADN como armazón programable en la investigación biológica se ha simplificado drásticamente al conectar las nanoestructuras de ADN con FP que se encuentran comúnmente en las células, la biología del desarrollo y la bioquímica de proteínas.

5. Discusión sobre perspectivas futuras

En comparación con los anticuerpos tradicionales, los nanocuerpos tienen mejores propiedades físicas y químicas y son más fáciles de expresar y detectar. Los nanocuerpos tienen una estructura mucho más simple que los anticuerpos convencionales. Están codificados por un único gen y pueden ser producidos fácilmente por microorganismos, lo que reduce significativamente el coste de producción. Aunque los nanocuerpos representan un gran avance para la investigación de anticuerpos, aún es necesario resolver algunos problemas. Por un lado, tienen el inconveniente de un funcionamiento incómodo y un coste elevado de la inmunización de los animales. Además, como HCAb e IgNAR abundan en los monocitos de sangre periférica, los nanocuerpos que se dirigen a los antígenos FP generalmente se seleccionan a partir de bibliotecas inmunes específicas de camélidos o tiburones. Con la maduración de las tecnologías de construcción de bibliotecas y desarrollo de nanocuerpos, la detección de nanocuerpos específicos de FP a partir de bibliotecas sintéticas es una nueva dirección que superará los inconvenientes de inmunizar animales, acortará el período experimental y reducirá significativamente el costo. Por otro lado, aunque el cribado y expresión de nanocuerpos es relativamente sencillo, la obtención de nanocuerpos de FP con potenciales valores de aplicación es un proceso muy complicado. La detección de bibliotecas de nanocuerpos de fagos no puede evitar los falsos positivos causados ​​por la unión de la superficie del fago filamentoso con el antígeno, mientras que la pequeña capacidad de las bibliotecas de nanocuerpos de levaduras y bacterias es otro problema difícil en la detección de nanocuerpos.

Las aplicaciones de nanocuerpos contra la PF seguirán aumentando en el futuro. (1) Con el desarrollo de la tecnología de anticuerpos intracelulares, la detección de moléculas intracelulares en células vivas se ha vuelto accesible. Los nanocuerpos tienen ventajas únicas a este respecto, ya que (i) el nanocuerpo es pequeño y la eficiencia de entrada a las células es mucho mayor que la de los anticuerpos tradicionales; y (ii) el nanocuerpo puede expresarse y ser funcional en células vivas. (2) El nanocuerpo biespecífico es un tipo de anticuerpo modificado artificialmente que puede unirse específicamente a dos antígenos diferentes simultáneamente. Puede construirse fácilmente a partir de nanocuerpos monovalentes y expresarse en microorganismos. Por lo tanto, los nanocuerpos contra FP brindan una amplia perspectiva de aplicación para el desarrollo de nanocuerpos biespecíficos.

6. Conclusiones

Este artículo revisa el origen, estructura y propiedades de los FP. También se resumen los anticuerpos monoclonales y los nanocuerpos dirigidos a los FP y sus aplicaciones. Aunque los anticuerpos son herramientas valiosas para mostrar componentes biológicos en células inmovilizadas, el uso de anticuerpos tradicionales en células vivas se ve limitado por el plegamiento y ensamblaje ineficaces de sus cadenas ligeras y pesadas variables. La microinyección directa de anticuerpos es el método principal utilizado en aplicaciones intracelulares de anticuerpos, lo que supone un desafío técnico y estresante para las células. Los anticuerpos de dominio único derivados de camellos o tiburones reconocen antígenos a través de sus dominios variables de cadenas pesadas. Estos nanocuerpos pequeños y estables pueden expresarse y funcionar en células vivas. Por lo tanto, generar nanocuerpos dirigidos a los FP los hará más valiosos en la investigación biológica.

Referencias

1. Muyldermans, S. Nanobodies: anticuerpos naturales de dominio único. Año. Rev. Bioquímica. 2013, 82, 775–797. [Referencia cruzada] [PubMed]

2. Helma, J.; Cardoso, MC; Muyldermans, S.; Leonhardt, H. Nanocuerpos y aglutinantes recombinantes en biología celular. J. Biol celular. 2015, 209, 633–644. [Referencia cruzada] [PubMed]

3. Ashour, J.; Schmidt, FI; Hanke, L.; Cragnolini, J.; Cavallari, M.; Altenburgo, A.; Cervecero, R.; Ingram, J.; Zapatero, C.; Ploegh, HL La expresión intracelular de anticuerpos de dominio único de camélidos específicos para la nucleoproteína del virus de la influenza descubre características distintivas de su localización nuclear. J. Virol. 2015, 89, 2792–2800. [Referencia cruzada] [PubMed]

4. Manglik, A.; Kobilka, BK; Steyaert, J. Nanocuerpos para estudiar la estructura y función del receptor acoplado a proteína G. Año. Rev. Farmacol. Toxico. 2017, 57, 19–37. [Referencia cruzada]

5. Harmansa, S.; Hamaratoglu, F.; Affolter, M.; Caussinus, E. La extensión de Dpp es necesaria para el crecimiento del disco del ala medial, pero no para el lateral. Naturaleza 2015, 527, 317–322. [Referencia cruzada]

6. Yamagata, M.; Sanes, JR Reporter: fusiones de nanocuerpos (RANbodies) como reactivos inmunohistoquímicos versátiles, pequeños y sensibles. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 2018, 115, 2126–2131. [Referencia cruzada]

7. Ariotti, N.; Salón, TE; Rae, J.; Ferguson, C.; McMahon, K.-A.; Martel, N.; Webb, RE; Webb, RI; Teasdale, RD; Parton, RG Detección modular de proteínas marcadas con GFP para un cribado rápido mediante microscopía electrónica en células y organismos. Desarrollo. Celda 2015, 35, 513–525. [Referencia cruzada]

8. Fruholz, S.; Fäßler, F.; Kolukisaoglu, Ü.; Pimpl, P. El bloqueo de VSR desencadenado por nanocuerpos revela la recarga de ligandos en el Golgi. Nat. Comunitario. 2018, 9, 643. [Referencia cruzada]

9. Prole, DL; Taylor, CW Un conjunto de herramientas codificadas genéticamente de nanocuerpos funcionalizados contra proteínas fluorescentes para visualizar y manipular la señalización intracelular. BMC Biol. 2019, 17, 41. [Referencia cruzada]

10. Shimomura, O.; Johnson, FH; Saiga, Y. Extracción, purificación y propiedades de la equorina, una proteína bioluminiscente del hidromedusano luminoso, Aequorea. J. Celda. comp. Fisiol. 1962, 59, 223–239. [Referencia cruzada]

11. Prasher, D.; McCann, RO; Cormier, MJ Clonación y expresión del ADNc que codifica la aequorina, una proteína bioluminiscente de unión al calcio. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 1985, 126, 1259–1268. [Referencia cruzada]

12. Heim, R.; Prasher, CC; Tsien, RY Mutaciones de longitud de onda y autooxidación postraduccional de proteína verde fluorescente. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 1994, 91, 12501–12504. [Referencia cruzada]

13. Matz, M.; Fradkov, AF; Labas, YA; Savitsky, A.; Zaraisky, AG; Markélov, ML; Lukyanov, SA Proteínas fluorescentes de especies de antozoos no bioluminiscentes. Nat. Biotecnología. 1999, 17, 969–973. [Referencia cruzada]

14. Parque, N.; Canción, J.; Jeong, S.; Tran, TT; Ko, HW; Kim, EY La quinasa 3 relacionada con Vaccinia (VRK3) establece el período circadiano y la amplitud al afectar la localización subcelular de las proteínas del reloj en las células de mamíferos. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 2017, 487, 320–326. [Referencia cruzada]

15. Zhao, D.; Xue, C.; Lin, S.; Shi, S.; Li, Q.; Liu, M.; Cai, X.; Lin, Y. La vía de señalización de Notch regula la angiogénesis a través de células endoteliales en un modelo de cocultivo 3D. J. Celda. Fisiol. 2016, 232, 1548–1558. [Referencia cruzada]

16. Rodríguez, EA; Campbell, RE; Lin, JY; Lin, MZ; Miyawaki, A.; Palmer, AE; Shu, X.; Zhang, J.; Tsien, RY La creciente y brillante caja de herramientas de proteínas fluorescentes y fotoactivas. Tendencias Bioquímica. Ciencia. 2017, 42, 111-129. [Referencia cruzada]

17. Yang, F.; musgo, LG; Phillips, GN, Jr. La estructura molecular de la proteína verde fluorescente. Nat. Biotecnología. 1996, 14, 1246–1251. [Referencia cruzada]

18. Ormö, M.; Cubitt, AB; Kallio, K.; Bruto, Luisiana; Tsien, RY; Remington, SJ Estructura cristalina de la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria. Ciencia 1996, 273, 1392-1395. [Referencia cruzada]

19. Reid, BG; Flynn, Formación de cromóforos GC en proteína fluorescente verde. Bioquímica 1997, 36, 6786–6791. [Referencia cruzada]

20. Zhang, G.; Gurtu, V.; Kain, SR Una proteína fluorescente verde mejorada permite la detección sensible de la transferencia de genes en células de mamíferos. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 1996, 227, 707–711. [Referencia cruzada]

21. Pédelacq, J.-D.; Cabantous, S.; Tran, T.; Terwilliger, T.; Waldo, GS Ingeniería y caracterización de una proteína fluorescente verde supercarpeta. Nat. Biotecnología. 2006, 24, 79–88. [Referencia cruzada] [PubMed]

22. Crameri, A.; Whitehorn, EA; Tate, E.; Stemmer, WP mejoró la proteína fluorescente verde mediante evolución molecular mediante mezcla de ADN. Nat. Biotecnología. 1996, 14, 315–319. [Referencia cruzada] [PubMed]

23. Miura, H.; Inoko, H.; Inoue, yo; Tanaka, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M. Estrategia de clonación simple utilizando el gen GFPuv como indicador positivo/negativo. Anal. Bioquímica. 2011, 416, 237–239. [Referencia cruzada] [PubMed]

24. Mena, MA; Treynor, TP; Mayo, SL; Daugherty, PS Proteínas fluorescentes azules con brillo y fotoestabilidad mejorados a partir de una biblioteca estructuralmente específica. Nat. Biotecnología. 2006, 24, 1569–1571. [Referencia cruzada] [PubMed]

25. Ai, H.; Shaner, N.; Cheng, Z.; Tsien, RY; Campbell, RE La exploración de nuevas estructuras cromóforas conduce a la identificación de proteínas fluorescentes azules mejoradas. Bioquímica 2007, 46, 5904–5910. [Referencia cruzada]

26. Subach, OM; Gundorov, IS; Yoshimura, M.; Subach, FV; Zhang, J.; Grüenwald, D.; Souslova, EA; Chudakov, DM; Verkhusha, VV Conversión de proteína fluorescente roja en una sonda azul brillante. Química. Biol. 2008, 15, 1116–1124. [Referencia cruzada]

27. Merzlyak, E.; Goedhart, J.; Shcherbo, D.; Bulina, ME; Shcheglov, AS; Fradkov, AF; Gaintzeva, A.; Lukyanov, K.; Lukyanov, S.; Gadella, T.; et al. Proteína fluorescente roja monomérica brillante con una vida útil de fluorescencia prolongada. Nat. Métodos 2007, 4, 555–557. [Referencia cruzada]

28. Cubitt, AB; Heim, R.; Adams, SR; Boyd, AE; Bruto, Luisiana; Tsien, RY Comprensión, mejora y uso de proteínas fluorescentes verdes. Tendencias Bioquímica. Ciencia. 1995, 20, 448–455. [Referencia cruzada]

29. Tomosugi, W.; Matsuda, T.; Tani, T.; Nemoto, T.; Kotera, I.; Saito, K.; Horikawa, K.; Nagai, T. Una proteína fluorescente ultramarina con mayor fotoestabilidad e insensibilidad al pH. Nat. Métodos 2009, 6, 351–353. [Referencia cruzada]

30. Goedhart, J.; van Weeren, L.; Hink, MA; Vischer, NOE; Jalink, K.; Gadella, TWJ Variantes de proteína fluorescente cian brillante identificadas mediante detección de vida útil de fluorescencia. Nat. Métodos 2010, 7, 137–139. [Referencia cruzada]

31. Día, enfermera registrada; Davidson, MW La paleta de proteínas fluorescentes: herramientas para la obtención de imágenes celulares. Química. Soc. Rev. 2009, 38, 2887–2921. [Referencia cruzada]

32. Griesbeck, O.; Baird, GS; Campbell, RE; Zacarías, DA; Tsien, RY Reducción de la sensibilidad ambiental de la proteína fluorescente amarilla. J. Biol. Química. 2001, 276, 29188–29194. [Referencia cruzada]

33. Nagai, T.; Ibata, K.; Parque, ES; Kubota, M.; Mikoshiba, K.; Miyawaki, A. Una variante de proteína fluorescente amarilla con maduración rápida y eficiente para aplicaciones de biología celular. Nat. Biotecnología. 2002, 20, 87–90. [Referencia cruzada]

34. Shaner, Carolina del Norte; Campbell, RE; Steinbach, Pensilvania; Giepmans, BN; Palmer, AE; Tsien, RY Proteínas fluorescentes monoméricas rojas, naranjas y amarillas mejoradas derivadas de Discosoma sp. proteína fluorescente roja. Nat. Biotecnología. 2004, 22, 1567–1572. [Referencia cruzada]

35. Shcherbo, D.; Merzlyak, EM; Chepurnykh, TV; Fradkov, AF; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Lukyanov, KA; Bogdanova, EA; Zaraisky, AG; Lukyanov, S.; et al. Proteína fluorescente de color rojo lejano brillante para imágenes de cuerpo entero. Nat. Métodos 2007, 4, 741–746. [Referencia cruzada]

36. Shcherbo, D.; Murphy, CS; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Chepurnykh, TV; Shcheglov, AS; Verkhusha, V.; Pletnev, VZ; Hazelwood, KL; Roche, primer ministro; et al. Etiquetas fluorescentes de color rojo lejano para obtener imágenes de proteínas en tejidos vivos. Bioquímica. J. 2009, 418, 567–574. [Referencia cruzada]

37. Oliinyk, OS; Chernov, KG; Verkhusha, VV Fitocromos bacterianos, cianobacteriocromos y aloficocianinas como fuente de sondas fluorescentes de infrarrojo cercano. En t. J. Mol. Ciencia. 2017, 18, 1691. [Referencia cruzada]

38. Shu, X.; Royant, A.; Lin, MZ; Aguilera, TA; Lev-Ram, V.; Steinbach, Pensilvania; Tsien, RY Expresión en mamíferos de proteínas fluorescentes infrarrojas diseñadas a partir de un fitocromo bacteriano. Ciencia 2009, 324, 804–807. [Referencia cruzada]

39. Yu, D.; Gustafson, WC; Han, C.; Lafaye, C.; Noirclerc-Savoye, M.; Ge, W.-P.; Thayer, fiscal del distrito; Huang, H.; Kornberg, TB; Royant, A.; et al. Una proteína fluorescente infrarroja monomérica mejorada para imágenes cerebrales neuronales y tumorales. Nat. Comunitario. 2014, 5, 3626. [Referencia cruzada]

40. Yu, D.; Baird, MA; Allen, JR; Howe, ES; Klassen, diputado; Reade, A.; Makhijani, K.; Canción, Y.; Liu, S.; Murthy, Z.; et al. Una proteína fluorescente infrarroja naturalmente monomérica para el etiquetado de proteínas in vivo. Nat. Métodos 2015, 12, 763–765. [Referencia cruzada]

41. Shcherbakova, DM; Balabán, M.; Emelyanov, AV; Brenowitz, M.; Guo, P.; Verkhusha, VV Proteínas fluorescentes monoméricas brillantes del infrarrojo cercano como etiquetas y biosensores para imágenes multiescala. Nat. Comunitario. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. Rodríguez, EA; Tran, GN; Bruto, Luisiana; Crujiente, JL; Shu, X.; Lin, JY; Tsien, RY Una proteína fluorescente de color rojo lejano evolucionó a partir de una ficobiliproteína de cianobacteria. Nat. Métodos 2016, 13, 763–769. [Referencia cruzada] [PubMed]

43. Oliinyk, OS; Shemetov, AA; Pletnev, S.; Shcherbakova, DM; Verkhusha, VV La proteína fluorescente más pequeña del infrarrojo cercano evolucionó a partir de la cianobacteriocromo como una etiqueta versátil para la multiplexación espectral. Nat. Comunitario. 2019, 10, 279. [Referencia cruzada]

44. Oliinyk, OS; Balabán, M.; Clark, CL; Carey, E.; Pletnev, S.; Nimmerjahn, A.; Verkhusha, VV La proteína del infrarrojo cercano de dominio único proporciona un andamio para nanocuerpos fluorescentes dependientes de antígenos. Nat. Métodos 2022, 19, 740–750. [Referencia cruzada] [PubMed]

45. Tiller, KE; Tessier, PM Avances en el diseño de anticuerpos. Año. Rev. Biomed. Ing. 2015, 17, 191–216. [Referencia cruzada]

46. ​​Gengyo-Ando, ​​K.; Mitani, S. 1020 Producción y caracterización de un anticuerpo monoclonal contra la proteína verde fluorescente (GFP). Neurociencias. Res. 1997, 28, S122. [Referencia cruzada]

47. Zhuang, R.; Zhang, Y.; Zhang, R.; Canción, C.; Yang, K.; Yang, A.; Jin, B. Purificación de proteínas de fusión GFP con alta pureza y rendimiento mediante cromatografía en columna de afinidad acoplada a anticuerpos monoclonales. Expr. de proteína Purif. 2008, 59, 138-143. [Referencia cruzada]

48. Ward, ES; Güssow, D.; Griffiths, AD; Jones, PT; Winter, G. Actividades de unión de un repertorio de dominios variables de inmunoglobulina individuales secretados por Escherichia coli. Naturaleza 1989, 341, 544–546. [Referencia cruzada]

49. Hamers-Casterman, C.; Atarhouch, T.; Muyldermans, S.; Robinson, G.; Martillos, C.; Songa, EB; Bendahman, N.; Hammers, R. Anticuerpos naturales desprovistos de cadenas ligeras. Naturaleza 1993, 363, 446–448. [Referencia cruzada]

50. Greenberg, AS; Ávila, D.; Hughes, M.; Hughes, A.; McKinney, CE; Flajnik, MF Una nueva familia de genes de receptores de antígenos que sufre una reordenación y una amplia diversificación somática en los tiburones. Nat. Biol celular. 1995, 374, 168-173. [Referencia cruzada]

51. De Meyer, T.; Muyldermans, S.; Depicker, A. Productos basados ​​en nanocuerpos como herramientas de investigación y diagnóstico. Tendencias Biotecnología. 2014, 32, 263–270. [Referencia cruzada]

52. Skerra, A. Andamios alternativos sin anticuerpos para el reconocimiento molecular. actual. Opinión. Biotecnología. 2007, 18, 295–304. [Referencia cruzada]

53. Muyldermans, S.; Baral, T.; Retamozzo, VC; De Baetselier, P.; De Genst, E.; Kinne, J.; Leonhardt, H.; Magez, S.; Nguyen, V.; Revets, H.; et al. Inmunoglobulinas de camélidos y tecnología de nanocuerpos. Veterinario. Inmunol. Inmunopatol. 2009, 128, 178–183. [Referencia cruzada]

54. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Tilib, S.; Nowak, D.; Schermelleh, L.; Gahl, A.; Backmann, N.; Conrath, K.; Muyldermans, S.; Cardoso, MC; et al. Dirigirse y rastrear antígenos en células vivas con nanocuerpos fluorescentes. Nat. Métodos 2006, 3, 887–889. [Referencia cruzada]

55. Kubala, MH; Kovtun, O.; Alejandrov, K.; Collins, BM Análisis estructural y termodinámico de la GFP: complejo GFP-nanocuerpo. Ciencia de las proteínas. 2010, 19, 2389–2401. [Referencia cruzada]

56. Colmillo, Z.; Cao, D.; Qiu, J. Desarrollo y producción de nanocuerpos específicamente contra la proteína de fluorescencia verde. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 2020, 104, 4837–4848. [Referencia cruzada]

57. Kirchhofer, A.; Helma, J.; Schmidthals, K.; Frauer, C.; Cui, S.; Karcher, A.; Pellis, M.; Muyldermans, S.; Casas-Delucchi, CS; Cardoso, MC; et al. Modulación de las propiedades de las proteínas en células vivas mediante nanocuerpos. Nat. Estructura. Mol. Biol. 2009, 17, 133-138. [Referencia cruzada]

58. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Muyldermans, S.; Schepers, A.; Cardoso, MC; Leonhardt, H. Una nanotrampa versátil para estudios bioquímicos y funcionales con proteínas de fusión fluorescentes. Mol. Celúla. Proteoma. 2008, 7, 282–289. [Referencia cruzada]

59. Fridy, P.; Li, Y.; Keegan, S.; Thompson, MK; Nudelman, I.; Scheid, JF; Oeffinger, M.; Nussenzweig, MC; Fenyö, D.; Chait, BT; et al. Una tubería sólida para la producción rápida de repertorios de nanocuerpos versátiles. Nat. Métodos 2014, 11, 1253–1260. [Referencia cruzada]

60. Zhang, Z.; Wang, Y.; Ding, Y.; Hattori, M. Ingeniería basada en estructuras de tándems de nanocuerpos anti-GFP como reactivos de ultra alta afinidad para la purificación. Ciencia. Rep. 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. Twair, A.; Al-Okla, S.; Zarkawi, M.; Abbady, AQ Caracterización de nanocuerpos de camello específicos para proteínas de fusión GFP de supercarpeta. Mol. Biol. Representante 2014, 41, 6887–6898. [Referencia cruzada] [PubMed]

62. Zhong, P.; Wang, Z.; Cheng, S.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Liu, R.; Ding, Y. Conocimientos estructurales sobre dos nanocuerpos distintos que reconocen el mismo epítopo de proteína verde fluorescente. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 2021, 565, 57–63. [Referencia cruzada] [PubMed]

63. Zhou, X.; Hao, R.; Chen, C.; Su, Z.; Zhao, L.; Luo, Z.; Xie, W. Entrega rápida de nanocuerpos/VHH en células vivas mediante la expresión de ARNm transcrito in vitro. Mol. Ther.-Métodos Clin. Desarrollo. 2020, 17, 401–408. [Referencia cruzada] [PubMed]

64. Wei, L.; Wang, M.; Xiang, H.; Jiang, Y.; Gong, J.; Su, D.; Al Azad, MAR; Dong, H.; Feng, L.; Wu, J.; et al. El tiburón bambú como modelo de animal pequeño para la producción de anticuerpos de dominio único. Frente. Bioeng. Biotecnología. 2021, 9, 792111. [Referencia cruzada]

65. Li, S.; Shan, H.; Wang, T.; Zheng, X.; Shi, M.; Chen, B.; Lu, H.; Zhang, Y.; Zhao, S.; Hua, Z. Generación de nanocuerpos de unión a proteínas fluorescentes mWasabi. Anal. Bioquímica. 2020, 608, 113875. [Referencia cruzada]

66. Ries, J.; Kaplan, C.; Platonova, E.; Eghlidi, HM; Ewers, H. Un método simple y versátil para microscopía de superresolución basada en GFP mediante nanocuerpos. Nat. Métodos 2012, 9, 582–584. [Referencia cruzada]

67. Beghein, E.; Gettemans, J. Tecnología de nanocuerpos: un conjunto de herramientas versátil para imágenes microscópicas, análisis de la interacción proteína-proteína y exploración de la función de las proteínas. Frente. Inmunol. 2017, 8, 771. [Referencia cruzada]

68. Platonova, E.; Inundación de invierno, CM; Junemann, A.; Alberto, D.; Faix, J.; Ewers, H. Microscopía de molécula única de moléculas marcadas con derivados de GFP o RFP en células de mamíferos utilizando aglutinantes de nanocuerpos. Métodos 2015, 88, 89–97. [Referencia cruzada]

69. Hercé, HD; Schumacher, D.; Schneider, AF; Ludwig, Alaska; Mann, FA; Potras, M.; Kasper, MA; Reinke, S.; Krause, E.; Leonhardt, H.; et al. Nanocuerpos permeables a las células para inmunomarcaje dirigido y manipulación de antígenos en células vivas. Nat. Química. 2017, 9, 762–771. [Referencia cruzada]

70. Payne, Carolina del Norte; Mazitschek, R. Tiny Titans: nanocuerpos como herramientas poderosas para el desarrollo de ensayos TR-FRET. Anal. Sens. 2022, 2, e202200020. [Referencia cruzada]

71. Wendel, S.; Fischer, CE; Martínez, V.; Seppälä, S.; Nørholm, MHH Un nanocuerpo: plataforma bacteriana GFP que permite la visualización de enzimas funcionales y una fácil cuantificación de la capacidad de visualización. Microbio. Fábricas de células 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. Seitz, KJ; Rizzoli, SO Los nanocuerpos de GFP revelan moléculas de pHluorina recientemente exocitadas. Ciencia. Rep. 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. Caussinus, E.; Kanca, O.; Affolter, M. Eliminación de proteínas de fusión fluorescente mediada por nanocuerpos anti-GFP. Nat. Estructura. Mol. Biol. 2011, 19, 117-121. [Referencia cruzada]

74. Shin, YJ; Parque, SK; Jung, YJ; Na Kim, Y.; Kim, Kansas; Estacionar, OK; Kwon, SH-H.; Jeon, SH; Trinh, Luisiana; Fraser, S.; et al. El complejo E3-ubiquitina ligasa dirigido a nanocuerpos degrada las proteínas nucleares. Ciencia. Rep. 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. Baudisch, B.; Pfort, I.; Sorge, E.; Conrad, U. Degradación específica de proteínas dirigida por nanocuerpos mediante el proteasoma 26S en plantas. Frente. Ciencia vegetal. 2018, 9, 130. [Referencia cruzada]

76. Croucher, DR; Iconomou, M.; Hastings, JF; Kennedy, SP; Han, JZR; Esquilador, RF; McKenna, J.; Wan, A.; Lau, J.; Aparicio, S.; et al. La purificación por afinidad de complementación bimolecular (BiCAP) revela interacciones de proteínas específicas de dímero para los dímeros ERBB2. Ciencia. Señal. 2016, 9, 436. [Referencia cruzada]

77. Tang, JC; Szikra, T.; Kozorovitskiy, Y.; Teixeira, M.; Sabatini, BL; Roska, B.; Cepko, CL Un sistema basado en nanocuerpos que utiliza proteínas fluorescentes como andamios para la manipulación de genes específicos de células. Celda 2013, 154, 928–939. [Referencia cruzada]

78. Sommese, RF; Hariadi, RF; Kim, K.; Liu, M.; Tyska, MJ; Sivaramakrishnan, S. Modelado de complejos de proteínas en nanoestructuras de ADN utilizando un nanocuerpo GFP. Ciencia de las proteínas. 2016, 25, 2089–2094. [Referencia cruzada]