La tolerancia a NADH/NAD más el desequilibrio anticipa el envejecimiento y las intervenciones antienvejecimiento

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RESUMEN

Las parejas redox coordinan la función celular, pero las consecuencias de sus desequilibrios no están claras. Esto está algo asociado con las limitaciones de su cuantificación experimental. Aquí evitamos estas dificultades al presentar un enfoque que caracteriza los perfiles de tolerancia basados ​​en la aptitud para los desequilibrios de la pareja redox utilizando una presentación del metabolismo en silicona. Centrándonos en la pareja redox NADH/NAD1 en la levadura, demostramos que los desequilibrios reductivos generan síndromes metabólicos comparables a los observados en las células cancerosas.beneficios del extracto de cistancheLa tolerancia de los mutantes de levadura al desequilibrio redox también puede explicar el 30 por ciento de la variabilidad en su vida útil cronológica medida experimentalmente. Además, al predecir la importancia de algunos metabolitos para ayudar a soportar los desequilibrios, identificamos correctamente los nutrientes que subyacen a los mecanismos patológicos, las moléculas que protegen la vida útil o los miméticos de la restricción calórica. La tolerancia a los desequilibrios redox se convierte, de esta manera, en un sonido que proporciona un marco para reconocer las propiedades del fenotipo de envejecimiento, al mismo tiempo que es coherente con una lógica biológica para evaluar las intervenciones antienvejecimiento.

INTRODUCCIÓN

La investigación sobre la homeostasis redox se expandió sustancialmente en las últimas dos décadas, remodelando continuamente las nociones clásicas del daño celular oxidativo (Halliwell y Gutteridge, 2015). Entre los agentes moleculares más paradigmáticos que subyacen a esta homeostasis emergen las relaciones de parejas redox, como las de las formas conjugadas de glutatión, NADPH y NADH. Tanto el glutatión como el NADPH actúan como mecanismos esenciales de eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las mitocondrias, mientras que el NADPH y el NADH acoplan vías anabólicas y catabólicas, respectivamente, con el estado redox de la célula.

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Aun así, se siguen reconociendo nuevos mecanismos que vinculan los pares NADPH/NADP* y NADH/NAD* con la homeostasis redox. Por ejemplo, el equilibrio de NADPH/NADP plus explica parcialmente las consecuencias a favor de la supervivencia de la proteína quinasa activada por AMP (She et al., 2014). Además, asocia el cronometraje circadiano con estados redox (Rey et al., 2016). Actualmente se cree que la relación NADH/NAD plus está involucrada en la coordinación de la función mitocondrial y nuclear, la regulación epigenética de la reparación del ADN y la identidad celular, y la sintonización del metabolismo energético con las variables ambientales (Canto et al., 2015; Gomes et al. otros 2013). En condiciones no patológicas, la relación NADH/NAD* fluctúa con la tensión de oxígeno, y las condiciones hipóxicas y la mayor disponibilidad de oxígeno coinciden con desviaciones reductivas y oxidativas (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Pero el creciente interés en las relaciones de pareja redox proviene principalmente de sus implicaciones en la patología.cistanche genghis khanLa aparición de ROS tanto en el sentido reductor (hipóxico, propenso a NADH) como en el oxidativo (hipérxico, propenso a NAD más) se ha relacionado con divergencias de un potencial redox óptimo que garantiza el mejor rendimiento de las mitocondrias (Aon et al., 2010). ; Clanton, 2007). Con respecto al cáncer, la disminución de NADH/NAD plus puede ser la base de la letalidad de los glioblastomas (Gujar et al., 2016) y promover la progresión del cáncer de colon (Hong et al., 2019), sin embargo, también puede rescatar algunos fenotipos saludables en diferentes grados en células de otros tipos de tumores (Garrido y Djouder, 2017).

Cistanche puede antienvejecimiento

NADH también se ha convertido en un punto de interés en la biología de Toronto. En este contexto, el aumento del conjunto de NAD plus resultó en la reversión parcial del envejecimiento y otros fenotipos patológicos relacionados en todos los organismos (Das et al., 2018; Mendelsohn y Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017), y se ha encontrado que las células senescentes y neoplásicas presentan desequilibrios de la relación NADH/NAD plus (Braidy et al., 2011; Schwartz y Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). Además, las funciones recién descubiertas de NADPH y el concepto emergente de NADH/NADH como regulador maestro de la homeostasis redox y la senescencia están en línea con la teoría de la estabilidad metabólica del envejecimiento (Demetrius, 2004). Esta teoría propone que la causa del envejecimiento es la vulnerabilidad de los niveles de estado estacionario de los pares redox a las perturbaciones ambientales aleatorias en las velocidades de reacción de las enzimas y hace varias predicciones interesantes que se aplican a los humanos.

Dadas todas estas implicaciones, muchos estudios han examinado la fenomenología de las relaciones de pareja redox, ya sea informando pasivamente sus niveles o modificándolos activamente. Sin embargo, las manipulaciones experimentales son desafiantes. Los más tradicionales acusan profundas advertencias experimentales (Sun et al., 2012) y los más nuevos aún pasan por alto ciertas circunstancias biológicas debido a que están restringidos a intervalos de temperatura y pH (Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). Además, es experimentalmente costoso monitorear la amplia gama de fenotipos luego de la alteración de los conjuntos de coenzimas mediante la suplementación con metabolitos (Hou et al., 2010) y mutaciones o sobreexpresión de enzimas que consumen NAD (H) (Bait al., 2011; Felipe et al., 1998). Por lo tanto, existe la necesidad de estrategias alternativas para abordar el control de la homeostasis redox mediante la manipulación de parejas redox, así como nuestra comprensión de las consecuencias biológicas de este control.

Los modelos in silico se convierten en una estrategia práctica de investigación siempre que los enfoques experimentales sean limitados, con la ventaja de permitir una descripción mecanicista completa de los fenómenos observados. Los modelos metabólicos a escala del genoma, que se pueden estudiar a través del análisis de equilibrio de flujo (FBA) (Orth et al, 2010) se han convertido en un estándar en biología de sistemas para estudiar las consecuencias de las perturbaciones metabólicas en la función celular (métodos S1). Entre otras contribuciones, han ayudado en el descubrimiento de nuevos antibióticos y quimioterapéuticos, el diseño de cepas bacterianas optimizadas para la producción industrial de sustancias de interés y una mejor comprensión de las enfermedades metabólicas humanas (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman et al., 2009). El uso de FBA tiene la ventaja adicional de proporcionar información sobre los fenómenos metabólicos sin la influencia de factores de confusión no metabólicos (genéticos, epigenéticos, mecánicos, etc.). Por lo tanto, los modelos metabólicos a escala del genoma son especialmente adecuados para examinar las consecuencias metabólicas de las desviaciones de la homeostasis redox.

Aquí, usamos FBA para sondear el equilibrio de las parejas redox en una reconstrucción a escala del genoma del eucariota unicelular Saccharomyces cerevisiae, mediante el cual caracterizamos las consecuencias metabólicas y relacionadas con la longevidad de una perturbación controlada del flujo NADH/NAD más disponible a través de diferentes genéticas. antecedentes. Más específicamente, nuestros resultados revelan que la tolerancia a este desequilibrio conduce a un desvío metabólico específico que recuerda a la patología y también explica más de una cuarta parte de la variabilidad intraespecífica en la vida postmitótica. Además, este marco nos ayuda a delinear un protocolo computacional (que también aplicamos a modelos metabólicos animales y humanos) para identificar metabolitos y enzimas con potencial como dianas terapéuticas en el contexto de patologías relacionadas con la edad.

RESULTADOS

Un perfil de tolerancia basado en la aptitud caracteriza las perturbaciones del par redox

Para representar un desequilibrio entre las formas conjugadas de una pareja redox, incorporamos una reacción reversible artificial, la "reacción de desequilibrio", en la reconstrucción a escala del genoma de la red metabólica correspondiente (métodos STAR). La reacción oxida o reduce la pareja considerando compartimentos celulares específicos (p. ej., citosol, mitocondrias, etc.), y su actividad se puede fijar a cualquier valor de velocidad deseado. Para cualquiera de estos valores, se puede calcular una tasa de crecimiento ("aptitud"), que actúa como indicador de la tolerancia de la célula de levadura a esa condición en particular. Finalmente, se define un perfil de tolerancia calculando la tasa de crecimiento para un rango de valores de desequilibrio (Figura 1A; tenga en cuenta que las condiciones reductoras/oxidativas están representadas en azul/rojo, respectivamente, en todo el manuscrito).

Los perfiles de tolerancia suelen exhibir un crecimiento máximo alrededor del punto de desequilibrio nulo, con aproximadamente cualquier desviación (es decir, el valor distinto de cero de la reacción) que conduce a una disminución de la aptitud. Esto enfatiza el hecho de que, para que el metabolismo funcione, la actividad de las reacciones que sintonizan una relación de pareja redox en un sentido debe ser proporcional a la actividad de aquellas que la sintonizan en el otro. Más específicamente, los desequilibrios citosólicos de NADH/NADt en S.prolongación de la vida de la cistanchecerevisiae que crecen en glucosa y condiciones aeróbicas producen un perfil con un crecimiento máximo significativamente desplazado hacia el lado oxidativo en un punto del perfil de desequilibrio donde ~50 mmol/DW/hora de NADH se convierten en NADH (Figura 1B). Al considerar, en cambio, el desequilibrio en las mitocondrias, observamos un máximo en el punto de desequilibrio nulo (Figura 1C), un patrón que observamos de manera similar en otros perfiles (Figura S1). En general, las condiciones reductivas se vuelven

Figura 1. Un perfil de tolerancia caracteriza la respuesta a los desequilibrios redox.

(Encima. Introdujimos una reacción artificial en el modelo de reconstrucción metabólica de un organismo (en este caso levadura) para interconvertir las dos formas conjugadas de una coenzima redox (aquí el par NADH/NADH). Bajo cada una de una serie de condiciones de desequilibrio, es decir, valores de velocidad de la reacción artificial, aplicamos análisis de balance de flujo para calcular la velocidad de crecimiento. Abajo. Los valores pronosticados de crecimiento se trazan frente a los valores de tasa de desequilibrio que delimitan el perfil de tolerancia; un proxy de la tolerancia del metabolismo ante la perturbación elegida.cistanche nueva zelanda(B) Perfil de tolerancia en levaduras asociado a desequilibrios localizados en el citosol.

(C) Perfil de tolerancia en la levadura asociado con desequilibrios ubicados en las mitocondrias. El sombreado azul/rojo representa regímenes de desequilibrio reducido y oxidado, respectivamente, y los puntos grises indican valores correspondientes a ningún desequilibrio o desequilibrios reductivos/oxidativos extremos que no producen crecimiento. perjudicial y letal más rápido que los regímenes oxidativos. En dos casos (los pares conjugados de NADH citosólico o tiorredoxina mitocondrial), la oxidación artificial leve de la pareja mejora el crecimiento (Figura S1).

Las perturbaciones de NADH/NAD* causan síndromes metabólicos que recuerdan a la patología

El metabolismo energético de la levadura sin desequilibrio corresponde a un metabolismo aeróbico característico en presencia de glucosa (las condiciones de crecimiento estudiadas) en el que la glucólisis se acopla con el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa. La ruta de las pentosas fosfato oxida la glucosa y proporciona ribosa-5P para la síntesis de nucleótidos y el poder reductor de NADPH para el anabolismo, mientras que las rutas anapleróticas parten del ciclo TCA, similar a las del metabolismo de la glutamina, se usan moderadamente para alimentar principalmente pirimidina y síntesis de aminoácidos. FBA nos permite cuantificar los cambios en estas vías y cómo eventualmente detallan los rasgos metabólicos que subyacen a cualquier régimen de desequilibrio particular.

Específicamente, la Figura 2A muestra cómo los desequilibrios reductivos de NADH/NADH citosólico produjeron un aumento en el flujo glucolítico, una disminución en la actividad del ciclo TCA y la cadena de transporte de electrones, y un aumento en el metabolismo de la glutamina. Esta firma metabólica pseudohipóxica -en presencia de oxígeno- se asemeja al metabolismo anaeróbico, donde la glucólisis se combina con la fermentación alcohólica o láctica en detrimento de las vías mitocondriales; la parte oxigénica de la vía de las pentosas fosfato se cierra y el metabolismo de la glutamina, que es más activo, podría desviarse para producir piruvato además de contribuir al anabolismo. En particular, este fenotipo captura algunas características de los metabolismos de rendimiento paradójico observados en diferentes tipos de células cancerosas (el efecto Warburg) (Potter et al., 2016).

Figura 2. Flujos de las principales vías de gestión de la energía subyacentes al perfil de tolerancia en la levadura (A) Desequilibrio citosólico de NADH/NAD (arriba) y valores de flujo de cinco vías representativas (abajo); i/glucólisis (glucólisis, núcleo), ii/ciclo de Krebs (TCA, rosa), ili/fosfato de pentosa (Penphos, verde), iv/fosforilación oxidativa (Oxphos, gris) y metabolismo de la glutamina (glutamina, púrpura). Los vectores de flujo representados son el resultado de promediar el flujo de todas las reacciones de la vía particular.

(B) Igual que (A) con respecto al desequilibrio mitocondrial. Tenga en cuenta que la presencia de flujos negativos en la glucólisis (panel A, parte inferior) representa un aumento de la gluconeogénesis. Ver texto principal para más detalles.

Por el contrario, el metabolismo energético subyacente a la tolerancia oxidativa (con respecto al citosol, Figura 2A) presentaba una configuración más aeróbica pero con peculiaridades, como un metabolismo de poliaminas particularmente activo; y propiedades extremas, incluido el aumento de la gluconeogénesis, la fosforilación oxidativa y la actividad del ciclo TCA, así como un flujo muy alto (hasta 12-veces el nivel normal) a través de la vía de las pentosas fosfato. Este último puede ser, sin embargo, un artefacto de las diferencias en la pseudorreacción de la biomasa, bajo un desequilibrio oxidativo muy alto (más de 55 mmol/gDW/h) (ver métodos S1).

Cuando la reacción de desequilibrio se localiza en la mitocondria, la reducción de NADH vuelve a producir cierto comportamiento pseudohipóxico, con una diferencia (Figura 2B). El flujo a través de la glucólisis y el metabolismo de la glutamina aumentó, con una pérdida concomitante de las partes del ciclo TCA y la ruta de las pentosas fosfato. Sin embargo, a diferencia del caso citosólico, la fosforilación oxidativa aumentó significativamente. Por otro lado, el lado oxidativo del perfil mitocondrial era más idiosincrásico: la actividad glucolítica aumentaba en paralelo con la del ciclo TCA, pero la fosforilación oxidativa funcionaba en su mayor parte a niveles más bajos de lo normal, y el metabolismo de la glutamina era de poca importancia.

Los síndromes metabólicos son el resultado de un compromiso entre el equilibrio redox, la producción de biomasa y una compensación de ATP/NADH

Identificamos varios elementos clave en juego que dieron forma a los síndromes anteriores.tamaño del pene cistancheLa perturbación oxidativa se encontró con una respuesta aeróbica exacerbada como compromiso entre mantener el crecimiento y amortiguar la perturbación del desequilibrio. Esto implicó redirigir el flujo a través del máximo número posible de reacciones que redujeron el NAD plus mientras se preservaba una distribución de flujo global que era capaz de generar componentes de biomasa. Estos dos elementos mecánicos (amortiguación de la perturbación y maximización de la biomasa) son los requisitos más relevantes del problema de optimización y suficientes para describir el régimen oxidativo del perfil de tolerancia.

Figura 3. Los mecanismos en competencia causan el comportamiento pseudohipóxico de la levadura.

(A) El equilibrio entre la producción de precursores de NADH, ATP y biomasa favorece los módulos de reacción que producen la mayor cantidad de ATP y la menor cantidad posible de NADH para compensar las consecuencias de los regímenes reductores, por ejemplo, el uso de la glucólisis en lugar del TCA. Nótese aquí que las flechas moradas representan la producción de ATP, las flechas amarillas representan la producción de NAD(H) y los círculos blancos indican la generación de precursores de biomasa. (B) Una perturbación de NADH/NADt propensa a NADH (eje x) se superpone con un ADP artificial reacción de fosforilación (eje y) que introduce con fuerza poder reductor en forma de ATP en el metabolismo desequilibrado. Un degradado de color verde representa la relación entre el flujo glucolítico y del ciclo de Krebs normalizado por su valor normal (hasta 100-veces). Se puede apreciar que la fosforilación de ADP reduce el fenotipo pseudohipóxico y retrasa la quiescencia.

El lado reduccionista requería, sin embargo, una percepción adicional. A medida que más y más NADH se secuestra a NADH, las reacciones que usan NADt y son directa o indirectamente necesarias para producir constituyentes de biomasa se vuelven cada vez más restringidas, por lo que el metabolismo energético debe ser redirigido para permitir una conversión elevada de NADH a NAD' y para limitar la reducción de NAD a NADH. Esto todavía es insuficiente para enfrentar la perturbación, ya que la mayor parte del poder reductor en forma de NADH es esencialmente inútil para muchos objetivos metabólicos, reacciones y crecimiento: la energía almacenada en NADH debe reasignarse a ADP. Por lo tanto, el metabolismo debe priorizar módulos de reacción que produzcan la mayor cantidad de ATP y la menor cantidad posible de NADH; debe depender de derivaciones y vías que tengan un alto rendimiento de ATP/NADH, por ejemplo, la glucólisis y la fosforilación oxidativa.

Estos resultados, entre otras cosas, reducen el ciclo de TCA y aumentan el flujo glucolítico (Figura 3A). Para explorar más a fondo el impacto de esta compensación de ATP/NADH, superpusimos una perturbación reductora de NADH/NAD con una reacción artificial que permite la fosforilación de ADP. . Las simulaciones mostraron que la proporción elevada de flujo de ciclo de glucólisis a TCA que caracteriza el metabolismo reductor depende del rendimiento de ATP/NADH.

Figura 4. Puntuación de tolerancia como predictor de vida útil cronológica en levadura

(A) Perfiles de tolerancia obtenidos para mutantes de levadura; los sectores azul/rojo de la curva representan el régimen reductor/oxidativo del desequilibrio NADH/NADH.

(B) Asociación entre la puntuación de tolerancia normalizada (proporcional a la amplitud de los valores de desequilibrio en los regímenes oxidativo y reductor, métodos STAR) y la vida útil cronológica. La correlación explica ~30 por ciento de la variación total (R'= 0. 29, valor p=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Como una forma alternativa de ver esta asociación, obtuvimos un histograma de valores de pendiente de regresión obtenidos de diez mil asociaciones generadas aleatoriamente entre la puntuación de tolerancia y la vida útil. De esta muestra, encontramos solo 3 casos en los que la asociación entre el puntaje de tolerancia y los datos de vida útil es más fuerte que la encontrada (indicada por la línea vertical roja).

(Figura 3B). La fosforilación forzada de ADP reduce esta firma pseudohipóxica incluso frente a índices de desequilibrio propensos a NADH muy fuertes.

La tolerancia explica las diferencias experimentales de vida útil cronológica entre diferentes mutantes de levadura

A continuación, preguntamos en qué medida podría el perfil de tolerancia actuar como predictor de la esperanza de vida, dado que las parejas redox se han discutido como posibles determinantes de la esperanza de vida. Una forma de estudiar esto es calcular el perfil en diferentes mutantes (Figura 4A) y luego cuantificar cómo se corresponde con las medidas exactas de vida útil, la vida útil cronológica normalizada (CLS), disponible a partir de las curvas de supervivencia de mutantes medidas experimentalmente (Garay et al., 2014). Los CLS se calculan a partir de estas curvas de supervivencia de mutantes como el aumento de la supervivencia en fase estacionaria en relación con el tipo salvaje.

En FBA, las mutaciones en genes específicos se simulan restringiendo el flujo de las reacciones asociadas con ellos a través de reglas booleanas que relacionan cada reacción química con los ORF que se traducen para la enzima de la reacción (métodos STAR). Para cada uno de estos mutantes, calculamos un perfil de tolerancia mutante (Figura 4A) y usamos la suma de los valores absolutos de desequilibrio en los que la tasa de crecimiento se reduce a la mitad (tanto en el régimen reductor como en el oxidativo) como una puntuación escalar de tolerancia (STAR métodos).

Sin embargo, nuestro conjunto de mutantes estaba limitado por algunas restricciones (métodos STAR). En particular, fuimos incapaces de distinguir diferencias en la tolerancia por debajo de 10 ppm del valor del tipo salvaje sin alcanzar tiempos de cálculo prohibitivos, y muchos mutantes presentaron diferencias insignificantes en la vida útil y diferencias insignificantes en la tolerancia. Además, generalmente se considera que FBA es incapaz de caracterizar las deleciones de ganancia de función y, como era de esperar, ninguna tolerancia mutante superó la del tipo salvaje.

Más allá de estas limitaciones, los perfiles de tolerancia in silico pudieron explicar el -30 por ciento de la variabilidad de la vida útil medida experimentalmente (Figura 4B, R2= 0.29, N=41, valor p{{5 }}.2x 10-) con gran significado: 10,000 las aleatorizaciones de los pares de datos llevaron a solo 3 instancias con una pendiente de regresión mayor (Figura 4C).

Los nutrientes convencionales permiten la tolerancia a los desequilibrios NADH/NADH

Por último, investigamos si los metabolitos dietéticos específicos eran particularmente determinantes en la respuesta al desequilibrio redox. Con este fin, utilizamos una característica adicional de los modelos FBA, que es la posibilidad de acceder al uso de un metabolito en particular (definido como la tasa de consumo en los métodos STAR de estado estacionario). Examinamos la forma en que esta tasa cambió con valores crecientes de NADH/NAD más el desequilibrio reductor y oxidativo.

El uso fue bastante lineal en ambos lados del perfil y para la mayoría de los metabolitos. Por lo tanto, ajustamos este patrón cambiante a un modelo lineal y consideramos la pendiente (absoluta) como un representante escalar de la relevancia del metabolito correspondiente para tolerar el desequilibrio redox (Figura 5A). Entre los principales nutrientes sensibles de iAZ900, notamos metabolitos dietéticos que se sabe que juegan un papel fundamental en la regulación de la vida útil de la levadura, como el acetato (Burtner et al., 2009), así como muchos que aumentan la vida útil experimentalmente en levadura, gusanos, o incluso células humanas (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016) que incluyen malato, hidroxibutirato, espermidina u oxaloacetato (Figuras 5B-5D, Tabla S1).

Ciertos nutrientes fueron más relevantes para la tolerancia a la reducción de NAD, otros a la oxidación de NADH y algunos a ambos regímenes. Los metabolitos dietéticos más importantes para la tolerancia reductora fueron, en orden, acetato, beta-hidroxibutirato (BHB), glutamato y glutamina (Figura 5B), mientras que los más importantes para tolerar la oxidación de NADH fueron acetato, NADP plus, putrescina y espermidina. (Figura 5D). Entre los que participaron de la tolerancia en ambos lados del perfil, el más relevante fue en el orden acetato, glutamato, oxaloacetato y oxoglutarato (Figura 5C).

Consideramos modelos metabólicos en otros organismos para corroborar aún más qué nutrientes son determinantes en la respuesta a los desequilibrios (métodos S1, consulte también la Figura S2 para ver cómo cambian los flujos de las vías principales). Todos estos principales contribuyentes cambiaron, aunque no mucho, con alfa-cetoácidos, parejas redox, ciertas vitaminas y ciertos aminoácidos que son significativamente necesarios para controlar las perturbaciones de NADH/NADt en C.elegans y la reconstrucción humana. La reacción más frecuente al desequilibrio redox en estos organismos se relaciona con los metabolitos que median la homeostasis del pH, como acetato, bicarbonato, bifosfato, sodio, agua y otros similares. De manera similar, la relevancia del glutamato, la glutamina, el aspartato, la treonina, la serina y la glicina los distingue de otros aminoácidos y de la mayoría de los metabolitos. Los ácidos oxidados de tamaño mediano como el oxoglutarato, el malato y el oxaloacetato también desempeñan un papel en la tolerancia de manera constante, al igual que la biotina y algunos folatos (consulte la Tabla S1 para obtener una lista completa).

DISCUSIÓN

Proponemos aquí un enfoque alternativo para comprender las amplias consecuencias biológicas de los cambios en las parejas redox. Este enfoque se basa en modelos metabólicos in silico e introduce la noción de perfil de tolerancia como una medida que cuantifica la resiliencia celular a estos cambios.

Figura 5. Nutrientes homeostáticos en levadura

(A) Ejemplo de perfil de uso de un nutriente con sus correspondientes regresiones lineales reductoras (azules) y oxidativas (rojas) caracterizadas por pendientes m, y m., respectivamente (en valores absolutos). Incluimos el perfil de tolerancia citosólica en segundo plano como referencia.

(B) Pendientes de regresión lineal (m,) de los 4 nutrientes homeostáticos principales en el sentido reductivo de NADH/NAD más perturbación.

(C) Pendientes de regresión lineal de los 4 nutrientes principales que son homeostáticos en ambos sentidos de la perturbación; Azul: pendiente de regresión lineal reductiva; Rojo: pendiente de regresión lineal oxidativa.

(D) Pendientes de regresión lineal (m.) de los 4 principales nutrientes homeostáticos en el sentido oxidativo de NADH/NAD más perturbación.

Los ajustes metabólicos subyacentes al perfil revelan la presencia de un fenotipo pseudohipóxico asociado a los regímenes reductores de NADH. Este fenotipo recuerda a algunos metabolismos de energía de bajo rendimiento aparentemente paradójicos observados en cánceres (el efecto Warburg) y también se reconoce en levaduras (efecto Crabtree) y células bacterianas (metabolismo de desbordamiento) (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Potter et al., 2016). En los últimos años se ha planteado la posibilidad de que este comportamiento pueda deberse a restricciones en la asignación de recursos que surjan a tasas de crecimiento o consumo de glucosa comparativamente altas (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Sin embargo, el fenotipo pseudohipóxico que observamos es independiente de la tasa de crecimiento y la captación de glucosa y, de hecho, se presenta junto con tasas de crecimiento bajas (métodos STAR). Hemos demostrado que su causa radica en un intercambio ATP/NADH fundamental, una razón que está respaldada por un estudio experimental reciente (Maldo-nado y Lemasters, 2014).

Además, nuestro análisis de flujo sugiere que el mantenimiento de ATP puede verse afectado negativamente por desequilibrios reductores de NADH/NAD más. Se cree que el aumento de NADH se correlaciona con la disminución de la disponibilidad de ATP, ya que el deterioro de la fosforilación oxidativa podría resultar tanto en un aumento de NADH/NAD plus como en una disminución de ATP/ADP. Mostramos que los desequilibrios de NADH generados extrínsecamente pueden ser una causa de la disminución de la disponibilidad de energía a través de mecanismos metabólicos ortogonales, incluso cuando la fosforilación oxidativa funciona por encima de los niveles normales. Esto es muy importante en el contexto de la investigación sobre el envejecimiento, ya que la disminución de la disponibilidad de energía y las relaciones ATP/ADP son un sello distintivo conservado del envejecimiento celular y las patologías relacionadas con la edad (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013). ) y podría promover la acumulación de desechos tóxicos y la pérdida de proteostasis (otra característica del envejecimiento) al disminuir el recambio de proteínas y, por lo tanto, aumentar la vida media de las proteínas (Anisimova et al., 2018).

A continuación, nuestro objetivo es determinar la validez de nuestro marco como predictor de la vida útil y de los metabolitos dietéticos que amortiguan los desequilibrios redox. La tolerancia anticipa la vida útil celular, con algunas limitaciones debido al conjunto de datos disponible. Controlando estas limitaciones (Garay et al., 2014), encontramos que las correlaciones resultantes siguen siendo suficiente evidencia de una relación entre las varianzas de tolerancia y CLS.

Contrariamente a nuestras expectativas, la lección más clara extraída de nuestro análisis de los metabolitos dietéticos es que la sustancia principal que impulsa la respuesta al desequilibrio no depende particularmente de la red de recuperación de NADt. De hecho, los principales "nutrientes homeostáticos" son intermediarios del ciclo TCA y otras partes del metabolismo central cuya acción es mucho más profunda que la de los precursores de NAD. Además, la relevancia de las reacciones que reducen u oxidan NAD(H) mientras actúan como puentes entre el par redox y las principales vías metabólicas es muy superior a la de las enzimas limitantes de recuperación de NADt (como la nicotinamida mononucleótido adeniltransferasa).

Por ejemplo, el puntaje de oxaloacetato y oxoglutarato en el modelo de levadura se encuentra entre los cuatro metabolitos más efectivos que subyacen a la tolerancia en condiciones tanto reductoras como oxidativas, una característica consistente que corrobora resultados experimentales previos (Chin et al., 2014; Williams et al., 2009) . Otros metabolitos importantes incluyen el hidroxibutirato, que se ha demostrado consistentemente que aumenta la esperanza de vida, regula la NAD y media la respuesta a la inanición (Edwards et al., 2014; Newman y Verdin, 2014), y la espermidina, que pertenece a la familia de las poliaminas y se sabe que juegan un papel en los procesos relacionados con la edad, la autofagia y la protección del ADN (Eisenberg et al, 2009; Minois et al. 2011: Pietrocola et al. 2015).

Usamos C.elegans y modelos humanos para fortalecer la evaluación anterior, revelando una imagen más amplia que se centra en la homeostasis del pH, las parejas redox y el ciclo TCA. Esto sugiere que las formas en que el pH (Burtner et al., 2009) y el desequilibrio de NADH (Ayer et al., 2014) determinan la senescencia en las células están profundamente entrelazadas. Más allá del pH, los nutrientes más penetrantes e importantes para regular el desequilibrio NADH/NAD plus son los alfa-cetoácidos oxaloacetato y oxoglutarato, sus formas aminadas y otros metabolitos relacionados con las mitocondrias como el malato, el piruvato y el fumarato, es decir, el centro principal de El control del equilibrio redox es el ciclo TCA.

Hasta el día de hoy, los mecanismos a través de los cuales los aminoácidos y los intermediarios del ciclo TCA afectan la extensión de la vida en la levadura y C. elegans siguen siendo oscuros. Los metabolitos como el malato, el oxaloacetato, el fumarato, la valina, la serina o la treonina pueden aumentar la vida útil de los organismos, pero los procesos que conducen a estos efectos son debatidos y complejos (Edwards et al., 2013, 2015). Nuestros resultados indican que una explicación común para todos estos fenómenos de pro-longevidad radica en el efecto de los nutrientes sobre la capacidad de las células para tolerar perturbaciones en la relación NADH/NAD plus.

Sin embargo, se podría argumentar que algunos de los metabolitos considerados parecen evidentes, ya que, después de todo, están involucrados en reacciones que interconvierten NADH y NAD plus. La pregunta es entonces por qué otros metabolitos que también parecen evidentes a priori no aparecen en nuestros resultados. La respuesta está en los mecanismos que aseguran predicciones realistas en Logística de Amazon. Para que un nutriente sea "homeostático" contra el desequilibrio redox, no solo debe aumentar la producción de NADH o NADt, sino que también debe estar en una vía o módulo central con un alto rendimiento de ATP/NADH y/o capacidad para proporcionar constituyentes de biomasa.

Finalmente, dos ideas más de nuestros resultados son dignas de mención. Por un lado, sugieren que, en respuesta a los desequilibrios redox, las redes metabólicas están preparadas para producir y/o consumir cada vez más algunos metabolitos que las redes de señalización interpretan como que excluyen la necesidad de autofagia, respuestas antioxidantes y horméticas, así como muchos cuyo exceso o se ha encontrado que la suplementación aumenta la esperanza de vida y/o imita los efectos de la restricción calórica (CR), de una manera dependiente de las vías de señalización que están implicadas en la extensión de la esperanza de vida mediada por CR. Esto refuerza la evidencia previa que vincula la RC y el equilibrio NADH/NADH como parte del mismo proceso de prolongación de la vida y promoción de la salud (Lin et al., 2004).

Por otro lado, nuestro estudio muestra que, en respuesta a las proporciones alteradas, el metabolismo también hace un uso creciente de ciertas sustancias que pueden dañar químicamente la célula, como el acetato, la putrescina o el acetaldehído; así como algunos que pueden promover la tumorigénesis a través del cableado metabólico, como la glutamina, el succinato y el fumarato (Sciacovell et al., 2016). Esto podría explicar en parte las patologías relacionadas con el desequilibrio redox y los procesos macroscópicos en los que está involucrado, como las enfermedades degenerativas y oncológicas: si el desequilibrio redox debe amortiguarse con sustancias tóxicas, entonces estas sustancias son probablemente mecanismos de las patologías que co -Ocurrir con desequilibrio redox.

Nos damos cuenta de que nuestro enfoque del desequilibrio redox puede entenderse como una variación inusual del estudio de la robustez de la red metabólica y que puede acusar ciertas advertencias que dejan mucho margen de mejora. Con respecto a la robustez, los estudios que usan FBA tradicionalmente la definieron como un cambio de la solución objetiva (típicamente crecimiento) en respuesta a reducciones variables en las velocidades de reacción, por ejemplo (Edwards y Palsson, 2000), en lugar de una perturbación particular (desequilibrio redox). ) en los metabolitos como lo hacemos nosotros. Con respecto a las limitaciones de nuestro análisis, pueden vincularse a limitaciones intrínsecas de la propia FBA, como la ausencia de genes reguladores. En última instancia, la fiabilidad de nuestros resultados depende del poder predictivo de las reconstrucciones metabólicas: los modelos de levadura actuales son predictivos y avanzados, pero no son perfectos (Heavner y Price, 2015) y, aun así, son mucho mejores que los modelos más avanzados. reconstrucciones multicelulares precisas disponibles. A pesar de todas estas preocupaciones, hay muchas pruebas que justifican la creciente fidelidad de los modelos metabólicos al comportamiento natural.

Actualmente, la investigación predominante tiende a ignorar las posibles consecuencias negativas de disminuir indiscriminadamente la relación NADH/NADH. Esto se debe en parte a los beneficios prometedores que resultan de las disminuciones leves logradas experimentalmente, que incluyen la reducción de los fenotipos neoplásicos, la vida útil y la extensión de la vida útil. Sin embargo, hay evidencia emergente que recomienda extrema precaución con respecto a estos resultados positivos (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), así como un marco teórico sólido y sostenido experimentalmente que predice consecuencias negativas de la disminución de las relaciones NADH/NADH más allá de un umbral (Aon et al., 2010). Nuestros perfiles de tolerancia al desequilibrio NADH/NADt se adaptan a esta imagen emergente, ya que las desviaciones oxidativas leves pueden ser beneficiosas, pero las más altas son tan perjudiciales como el extremo opuesto.

Más específicamente, nuestros perfiles de tolerancia sugieren que, además de causar problemas químicos o fisiológicos, las proporciones NADH/NADH altas y bajas también deben enfrentar inconvenientes puramente metabólicos, incluida la disminución de la disponibilidad de energía y/o la producción biosintética. Además, y como hemos señalado, las limitadas observaciones experimentales disponibles sobre algunas de las cuestiones que abordamos parecen recordar los resultados que presentamos aquí.

Limitaciones del estudio

Los resultados presentados aquí mejorarían cuando los modelos empleados se perfeccionen más. Nuestro trabajo también adolece de las limitaciones intrínsecas de FBA como técnica. Por ejemplo, la información dinámica está fuera de alcance, dado que las versiones actualmente disponibles de análisis de flujo dinámico tienen un alcance demasiado reducido. De manera similar, la falta de restricciones de energía implícitas en el balance de flujo disminuye su predictibilidad para altas tasas de crecimiento. Esta debilidad ha motivado la incorporación de técnicas como CAFBA, tal y como consideramos en el manuscrito. Por último, sería interesante acceder a información regulatoria, que se pueda controlar y activar o desactivar fácilmente. En la actualidad, no existen enfoques estandarizados para implementar la regulación génica en FBA. La aplicación de puntuaciones de actividad de reacción a límites de restricción es prometedora en este sentido.

Este artículo está extraído de iScience 24, 102697, 23 de julio de 2021