Estudios toxicológicos sobre la seguridad del extracto de Cistanche Deserticola

Abstracto:

Objetivo Evaluar la toxicidad general ytoxicidad genética de Cistanche deserticola extractoy proporcionar una base paradesarrollando más estudios funcionales. Métodosprueba de toxicidad oral aguday una dosis repetida90-día toxicidad oralSe llevó a cabo una prueba en ratas para observar la toxicidad general deExtracto de cistanche deserticola. Se llevaron a cabo tres ensayos de mutagenicidad, incluida una prueba de mutación inversa bacteriana (prueba de Ames), un eritrocito policromático de médula ósea de ratón y una prueba de aberración cromosómica de mamíferos in vitro para evaluar la toxicidad genética del extracto de Cistanche deserticola. Todos los métodos de prueba se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares nacionales. Los datos experimentales se procesaron estadísticamente utilizando la prueba χ{{0}} o análisis de varianza. El nivel de prueba fue 0, 05.

Resultados Eldosis letal media oral aguda(LD50) deExtracto de cistanche deserticolatanto en ratones hembras como machos fue superior a 10g/kg. Los resultados de la prueba de Ames mostraron que el extracto de Cistanche deserticola no provocó ningún aumento de colonias de retromutación en todas las cepas analizadas y hubo un resultado negativo. Los resultados de los eritrocitos policromáticos de médula ósea de ratón mostraron que no había diferencias estadísticamente significativas (χ2=3. 036, 1. 755, todos P > 0. 05) en las tasas de micronúcleos en ratones hembra y macho entre los grupos de dosis y el disolvente. grupo control, y hubo un resultado negativo. Los resultados de la prueba de aberración cromosómica de mamíferos in vitro mostraron que con o sin sistema de activación metabólica, hubo diferencias estadísticamente significativas (χ2=13. 244,9. 955, todos P<0. 05) in chromosome aberration rate of Chinese hamster lung (CHL) cell between the positive control groups and the solvent control groups, and there were no statistically significant differences (χ 2 = 0. 436,1. 008, all P>0. 05) en la tasa de células de aberración cromosómica entre los grupos de dosis de extracto de Cistanche deserticola y los grupos de control de solvente, y hubo un resultado negativo. Durante el período de la prueba de toxicidad oral de dosis repetidas 90-días en ratas, las actividades, el consumo de alimentos y el consumo de agua de los animales fueron normales. No se observaron cambios de comportamiento evidentes ni manifestaciones de envenenamiento, ni tampoco se observó ninguna muerte. En comparación con el grupo de control, no se observaron anomalías obvias en la masa corporal, el consumo de alimentos, los índices hematológicos y bioquímicos, el peso de los órganos y el peso relativo de los órganos de las ratas en cada grupo de dosis. No se encontraron cambios patológicos anormales obvios en el examen histopatológico. Conclusión En las condiciones experimentales actuales, el extracto de Cistanche deserticola no tiene toxicidad general ni toxicidad genética, y se podrían llevar a cabo más estudios funcionales.

Palabras clave:Evaluación de seguridad;Extracto de cistanche deserticola; Toxicidad aguda; Toxicidad genética; Toxicidad general

MATERIA PRIMA DE CISTANCHE NATURAL EN VENTA

Los fitoquímicos son una clase de sustancias bioactivas de bajo peso molecular que contienen diversas funciones para la salud además de nutrientes esenciales en las plantas [1]. En los últimos años, con el continuo desarrollo de la ciencia de la nutrición, se han descubierto continuamente los efectos beneficiosos de diversos fitoquímicos en el cuerpo humano, como la antifatiga, la reducción de los lípidos en sangre y la mejora de la inmunidad. Cistanche deserticola, también conocido como espíritu de la tierra, cistanche y día, se conoce comúnmente como "ginseng del desierto" [2]. En mi país existen 6 especies y 1 variante, a saber, Cistanche deserticola, Cistanche alsa, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, Cistanche lanzhouensis, Cistanche ambigua y la variante Cistanche salsavar [3]. Cistanche deserticola crece principalmente en tierras salino-álcalis, tierras arenosas y ambientes desérticos. En mi país, se distribuye principalmente en la Región Autónoma de Mongolia Interior, la Provincia de Gansu y la Provincia de Shaanxi. Su extracto tiene beneficios para la salud como hidratar los intestinos, mejorar la inmunidad celular y proteger el hígado [4-7]. Actualmente, existen pocos estudios de toxicidad en animales sobre el extracto de Cistanche deserticola. Este estudio evaluó sistemáticamente su toxicidad aguda, toxicidad general y toxicidad genética para evaluar su seguridad y sentar las bases para futuras investigaciones en profundidad en el futuro.

1 Materiales y métodos

1.1 Materiales

1. 1. 1 Sustancia problema

El extracto de Cistanche deserticola es un sólido en polvo, producido y proporcionado por Inner Mongolia Yuhangren High-tech Industry Co., Ltd., número de lote: 211101. El consumo humano recomendado es de 0, 72 g/d, que se convierte en un consumo diario recomendado de 12 mg/kg·pc.

1. 1. 2 Animales de experimentación

Se adquirieron ratas Sprague-Dawley (SD) de grado adulto sanas y libres de patógenos específicos (SPF) de Hunan Slake Jingda Experimental Animal Co., Ltd., con un número de licencia de producción animal de SCXK (Xiang) 2019-0014. Se mantuvieron en la sala para animales con barrera de seguridad del Instituto de Control y Prevención de Enfermedades Ocupacionales de Hunan, con una temperatura de 21 a 24 grados y una humedad de 45 a 68 por ciento. El número de licencia de uso de animales experimentales es SYXK (Xiang) 2017-0001.

1. 1. 3 bacterias

Salmonella typhimurium deficiente en histidina. Las cepas son TA97, TA98, TA100 y TA102, todas proporcionadas por MOLTOX, EE. UU., e identificadas por nuestro laboratorio como que cumplen con los requisitos.

1. 1. Línea celular de pulmón de hámster chino (CHL) de 4 células, adquirida en el Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China).

1. 2 métodos

1. 2. 1 Prueba de toxicidad oral aguda

Esta prueba adoptó el método límite. Se seleccionaron 20 ratas SD con un peso corporal de 185,80 ~ 220, 00g, mitad hembras y mitad machos, y se mantuvieron en ayunas durante 16 h. Configure un grupo de dosis de 10,00g/kg·bw, tome 50,04 g de la muestra de prueba y agregue agua pura a 75,00 ml para preparar una solución de prueba con una concentración de 666,70. mg/ml. La solución de prueba se administró por vía oral a una dosis de 15,00ml/kg·bw. El período de observación fue de 14 días y diariamente se registraron los síntomas de intoxicación y muertes de los animales. Los animales fueron pesados ​​al inicio del experimento, al séptimo día después de la administración y al final del experimento. Después del período de observación, las ratas fueron sacrificadas mediante anestesia con CO2 y se completó el examen anatómico macroscópico de los animales.

1.2.2 Prueba de Ames

Configure 5 dosis de 50, 158, 500, 1580 y 5000ug/plato, y configure un grupo de control de mutación positivo y un grupo de control de solvente. Las sustancias positivas son azida sódica, 2-aminofluoreno, 1, 8-dihidroxiantraquinona y diclorotiazida, y el disolvente es agua pura. En esta prueba se instalaron tres platos paralelos para cada grupo de dosis. La prueba se llevó a cabo en dos sistemas con S9 (enzima microsomal hepática) y sin S9, y las células se cultivaron en una incubadora a temperatura constante de 37 grados durante 48 horas después de la administración.

1.2.3 Prueba de micronúcleos de eritrocitos policromáticos de médula ósea de ratón

Ratones Kunming, 25 hembras y 25 machos, con un peso corporal de 29,3~35,0g. La prueba estableció tres grupos de dosis de 2,5, 5,0 y 10.0g/kg·bw, un grupo de control positivo y un grupo de control de disolvente. La sustancia positiva fue ciclofosfamida (CP; fabricante: Baxter; número de lote: OH397A) y la dosis fue de 40 mg/kg·bw. El grupo de control de disolvente y el grupo de dosis recibieron 40 ml/kg de peso corporal, y el grupo de control positivo recibió 20 ml/kg de peso corporal. El método de administración fue administrar el fármaco dos veces en un plazo de 30 horas y la última administración se realizó 24 horas después de la primera administración. Se sacrificaron los animales 6 horas después de finalizar la administración, se tomó la médula ósea del esternón para su preparación y se contó bajo un microscopio el número de células que contenían micronúcleos (fabricante: Olympus, modelo: CX23).

1.2.4 Prueba de aberración cromosómica en células de mamíferos in vitro

La prueba estableció un grupo de control de solvente (agua pura), grupos de dosis de 250, 500 y 1000 ug/ml y un grupo de control positivo. Los controles positivos fueron 20 ug/ml de metanosulfonato de metilo (MMS) (fabricante: West Asia Reagent, número de lote: 20200109) (sin sistema de activación metabólica) y 10 ug/ml de ciclofosfamida (fabricante: Baxter, número de lote:

OH397A) (con sistema de activación metabólica). Después de confirmar que las células no están contaminadas, ajuste la concentración celular a 5 × 10

5/ml, agregue 2,00ml de suspensión celular a cada botella, luego agregue 3,00ml de medio águila modificado por Dulbecco (DMED) (fabricante: Zhejiang Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd. , número de lote: 22112501) y colocar en la incubadora durante aproximadamente 24 horas. Después de succionar el medio de cultivo del frasco, agregue 4,95 ml de medio completo DMEM (sin sistema de activación metabólica) o 4,45 ml de medio completo DMEM y 0,50 ml de solución mixta S9 (con sistema de activación metabólica) a cada frasco, y finalmente agregue 50 ul de la muestra de prueba preparada o de la muestra de control y coloque el frasco de cultivo en la incubadora (fabricante: Shanghai Lishen Scientific Instrument Co., Ltd., modelo: HF160W) durante 4 horas de exposición al veneno. Después de la infección, deseche el medio de cultivo, lave las células tres veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (fabricante: Zhejiang Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd., número de lote: 2109220213) y luego agregue 5.{{19} } ml de medio de cultivo completo DMEM en cada botella, cultive durante 24 horas y recolecte las células.

4 h antes de la cosecha, añadir 50 ul de colchicina 100 mg/ml a cada frasco, incubar durante 4 h, digerir con solución de tripsina al 0,25 % (fabricante: Zhejiang Jinuo Biopharmaceutical Technology Co., Ltd., número de lote: 22071201), centrifugar y recoger las células, preparar portaobjetos según el método de rutina, preparar un portaobjetos por frasco y teñir con tinción de Giemsa al 10 % [fabricante: China Pharmaceutical (Group) Shanghai Chemical Reagent Company, número de lote: 20220114].

Bajo una lente de inmersión en aceite (fabricante: Olympus, modelo: CX23), se analizaron 100 metafases en cada grupo, se observaron y registraron el número de células aberrantes, el tipo de aberración y las coordenadas del campo visual aberrante, y se registró la tasa de aberración cromosómica. calculado.

1.2.5 90-día de prueba de toxicidad oral en ratas

120 ratas SD, de 4 semanas de edad, mitad hembras y mitad machos, con un peso corporal de 75,5-97.0 g al inicio del ensayo para ratas hembras y 80,{{6} }.8 g para ratas macho. El experimento estableció tres grupos de dosis de 600, 1200 y 3600 mg/(kg·bw·d) y un grupo de control positivo, con 10 animales machos y hembras en cada grupo. Además, había un grupo satélite de control a medio plazo, un grupo satélite de control del período de recuperación, un grupo satélite de dosis alta a medio plazo y un grupo satélite de dosis alta del período de recuperación, con 5 ratones hembra y macho en cada grupo. La dosis de los grupos de dosis baja, media y alta fue equivalente a 50, 100 y 300 veces el consumo humano recomendado, respectivamente. La solución de prueba se preparó recientemente todos los días y el volumen de alimentación forzada fue de 10 ml/(kg·bw·d). Los animales fueron observados todos los días durante el experimento y se registraron sus condiciones generales. Al final del experimento, se extrajo sangre después de un ayuno de 16 horas, se midieron la rutina sanguínea y la bioquímica sanguínea, y se observaron lesiones orgánicas macroscópicas y exámenes histopatológicos.

1.3 Análisis estadístico

Para analizar los datos se utilizó el software estadístico IBM SPSS Statistics 20.0. La prueba de micronúcleos de eritrocitos de mamíferos se analizó estadísticamente mediante distribución de Poisson y análisis de varianza. La prueba de aberración cromosómica de células de mamíferos in vitro se analizó estadísticamente mediante la prueba de χ2. La prueba de toxicidad oral de 90- días se analizó estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional y/o prueba t. PAG<0.05 was considered statistically significant, and the test level was α = 0.05.