Ensayo TUNEL: una poderosa herramienta para la evaluación de lesiones renales

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resumen:El ensayo de etiquetado de extremo de muesca de dUTP de desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) es un ensayo establecido desde hace mucho tiempo que se utiliza para detectar la fragmentación de ADN asociada a la muerte celular (terminales de ADN 3'-OH) por endonucleasas. Debido a que estas enzimas son particularmente activas en el riñón, TUNEL se usa ampliamente para identificar y cuantificar la fragmentación del ADN y la muerte celular en cultivos.riñón células y riñones animales y humanos resultantes de lalesión tóxica o hipóxica. La caracterización temprana de TUNEL como un ensayo apoptótico ha dado lugar a numerosas interpretaciones erróneas de los mecanismos decelula renal lesión.Sin embargo, TUNEL se está volviendo cada vez más popular paralesión renalevaluación porque puede usarse universalmente en células cultivadas y tisulares y para todos los mecanismos de muerte celular. Además, es sensible, precisa, cuantitativa, se relaciona fácilmente con células o compartimentos de tejidos particulares y se puede combinar con inmunohistoquímica para permitir la identificación confiable de tipos de células o posibles mecanismos de muerte celular. Tradicionalmente, el análisis TUNEL se ha limitado a la presencia o ausencia de una señal TUNEL. Sin embargo, se puede obtener información adicional sobre el mecanismo de muerte celular a partir del análisis de patrones TUNEL.

tratamiento del trastorno renal de la excitación sexual con polvo de suplemento de cistanche

Introducción El ADN es la única molécula de la célula que se puede reparar, pero no se puede volver a sintetizar por completo después del daño. La destrucción del ADN es una de las etapas finales de un proceso de muerte celular de varios pasos, que es potencialmente reversible hasta el punto de fragmentación terminal del ADN. Por lo tanto, este último es un atributo común y un marcador mecánico de muerte celular irreversible [1,2]. La fragmentación del ADN asociada con la muerte celular generalmente se "visualiza" mediante el ensayo de marcaje de extremos de la desoxinucleotidil transferasa dUTP terminal (TUNEL), el escalonamiento del ADN o el ensayo del cometa [3]. La electroforesis de campo pulsado [4] y el ensayo de síntesis cebada con oligonucleótidos aleatorios (ROPS) [5] son ​​otros dos ensayos secundarios poco utilizados. El uso del ensayo cometa se limita únicamente a in vitro (células cultivadas) y su cuantificación requiere mucha mano de obra [6]. Es posible realizar ensayos de cometa en núcleos de células aisladas, pero se asocia con factores de confusión adicionales durante el aislamiento de los núcleos. El segundo, el ensayo de escalamiento de ADN, no es un método cuantitativo, y la esperanza inicial de que el patrón de escalera frente al frotis distinguiría entre apoptosis y necrosis, respectivamente, se desvaneció ya que este enfoque demostró ser poco confiable [7]. De los tres métodos principales, TUNEL es el más sensible, el que requiere menos tiempo y el de aplicación más universal. Se puede utilizar en células y tejidos cultivados y para todos los mecanismos de muerte celular. Es preciso, cuantitativo, se relaciona fácilmente con células o compartimentos tisulares particulares y se puede combinar con inmunohistoquímica para permitir una identificación confiable de los tipos de células o mecanismos de daño celular asociados con señales positivas de TUNEL [2].

Las roturas de ADN medibles por TUNEL son producidas principalmente por endonucleasas apoptóticas. Las endonucleasas más activas en el riñón son la desoxirribonucleasa 1 (DNasa I) y la endonucleasa G (EndoG) [8-10]. La ADNasa I es la endonucleasa apoptótica más activa y abundante en los mamíferos [11]. El riñón, las glándulas salivales, el páncreas y el intestino son órganos que se sabe que producen grandes cantidades de ADNasa I. Las células epiteliales de las glándulas salivales, el páncreas y el intestino secretan ADNasa I como enzima digestiva en el tracto alimentario. Algunas DNasa I celulares luchan contra el ADN "extraño" que invade las células huésped [12]. La ADNasa I no secretada presenta un peligro oculto para el ADN de la célula huésped, pero normalmente las ADNasas no actúan sobre el ADN de la célula huésped hasta que se lesiona o muere la célula. En el riñón, la ADNasa I es secretada por células epiteliales tubulares, presumiblemente para destruir virus y bacterias en la orina. Es probable que esta función se lleve a cabo junto con proteinasas, en particular, meprin, que es la principal proteinasa en la orina [13]. Aunque protege contra la infección, la presencia de ADNasa altamente activa en el riñón hace que este órgano sea vulnerable a lesiones, donde se sabe que la actividad de la ADNasa es citotóxica para las células huésped. Las ADNasas promueven la muerte celular inducida por estímulos tóxicos o hipóxicos y destruyen todas las células de ADN del riñón del huésped liberadas como resultado de la muerte celular.

Riñonesson órganos filtrantes que eliminan los compuestos tóxicos del cuerpo. La alta actividad de la ADNasa I en los riñones hace que las células renales sean muy sensibles a las lesiones causadas por compuestos tóxicos y sus productos metabólicos. Esto convierte a TUNEL en el método más adecuado y aplicable para medir el daño renal. En esta revisión, nos centraremos en TUNEL como un ensayo informativo, preciso y ampliamente utilizado para la medición de la muerte celular y la lesión tisular en el riñón. Discutiremos los aspectos de TUNEL en su aplicación a las enfermedades y lesiones renales e identificaremos las cualidades, las técnicas y las características infrautilizadas de TUNEL para promover el uso productivo y apropiado de este poderoso ensayo en la investigación, el diagnóstico y la terapia de las enfermedades renales. También discutiremos varios patrones de imagen TUNEL que se pueden vincular a los mecanismos de muerte celular. Los puntos planteados en esta revisión son ampliamente aplicables para el uso de TUNEL en órganos distintos al riñón.

Palabras clave:TUNEL; muerte celular; riñón; ADNasas; endonucleasas; lesión tisular

Principios TUNELEl ensayo TUNEL fue desarrollado en 1992 por Gorczyca et al. [14] y Gavrieli et al. [15], usando marcaje con fluorocromo y avidina-peroxidasa, respectivamente. En ese momento, había una necesidad desesperada de nuevos métodos para evaluar la apoptosis, y TUNEL llenó con éxito este vacío. Inicialmente comercializado como un ensayo para roturas de cadenas de ADN durante o asociadas con la apoptosis [14,16], en ausencia de mejores ensayos, TUNEL se convirtió rápidamente en el ensayo estándar para la apoptosis [17,18]. Sin embargo, los investigadores reconocieron casi de inmediato que TUNEL midió indiscriminadamente cualquier fragmentación de ADN, no solo la asociada con la apoptosis [19–21]. Sin embargo, la necesidad de ensayos apoptóticos era tan grande que los raros informes de TUNEL que no son específicos para la apoptosis generalmente se ignoraron. Esto condujo a una enorme cantidad de informes falsos positivos de apoptosis en el riñón y otros órganos, hasta el punto de que hasta el 20 por ciento de las células totales se informaron apoptóticas incluso sin lesión [22-25] cuando los cambios como tan pequeño como 0.01 por ciento podría ser una evidencia estadísticamente significativa de lesión tisular.

El ensayo TUNEL ha experimentado un renacimiento en los últimos años desde el fin del auge de los estudios de apoptosis hace unos años. Nuestra búsqueda en PubMed de artículos de revistas que involucran los términos "riñón" y "TUNEL" produjo más de 1500 resultados desde 1992 hasta 2020. En 2019, se publicaron 170 artículos, el número más alto en un solo año durante los últimos 28 años (Figura S1) y que constituyen la mayoría de los artículos encuestados para esta revisión. Numerosos estudios utilizaron la positividad de TUNEL como una medida universal de la muerte celular asociada a la fragmentación del ADN en otros tipos de muerte celular además de la apoptosis. Por ejemplo, TUNEL puede detectar la ferroptosis, una forma recientemente descubierta de muerte celular programada no apoptótica provocada por el daño oxidativo que se produce durante la isquemia-reperfusión (IR) renal en ratones [26]. Se ha demostrado que la piroptosis, que es una forma inflamatoria de muerte celular programada distinta de la apoptosis y la necrosis, está asociada con señales positivas de TUNEL [27,28]. Se observó positividad de TUNEL durante la necroptosis que contribuyó al agotamiento progresivo de las células del túbulo renal en ratas sometidas a nefrectomía subtotal [29]. En el riñón y otros tejidos, se han encontrado señales TUNEL positivas en necrosis [30,31], autofagia desregulada [32–35], anoikis [36,37], catástrofe mitótica [35,38], autólisis [39], pautólisis [39], proptosis [40] y aponeurosis [30], lo que demuestra que TUNEL es un ensayo verdaderamente universal para la muerte celular irreversible.

El ensayo TUNEL se basa en el etiquetado de los extremos 3'OH mediante una enzima de ADN específica del extremo 3'OH, la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (Figura). El uso de ADN polimerasa o ADN polimerasa de fragmento Klenow en lugar de TdT puede ayudar a determinar el tipo de extremos 3'OH (muescas, espacios u oligos sobresalientes) porque las ADN polimerasas necesitan una plantilla (la hebra de ADN opuesta) y, por lo tanto, no marcarán extremos colgantes o sobresalientes del ADN. Es importante recordar que la producción de extremos de ADN 3ZOH no es exclusiva de las endonucleasas apoptóticas (que degradan el ADN). Los extremos 3'OH del ADN son una señal importante de "comunicador", un denominador común de la mayoría de las enzimas del ADN. Son producidos y utilizados por casi todas las enzimas de ADN en eucariotas, incluidas las endonucleasas, exonucleasas, ADN polimerasas, ADN ligasas, ADN transferasas y topoisomerasas de reparación de ADN (apurínicas/apirimidínicas, AP). Además, los conjugados 3'Id 3z-azúcar o 3z-proteína pueden convertirse en terminales 3'OH mediante fosfatasas, glicosilasas y proteinasas, respectivamente. Esta es la razón por la que es necesaria una comprensión precisa de lo que se está midiendo para la aplicación exitosa de TUNEL y la interpretación de sus resultados.

En comparación con otros dos métodos primarios de medición de fragmentación de ADN, la escalera de ADN y el ensayo cometa, TUNEL tiene la ventaja de estar basado en la identificación de extremos de ADN en lugar de fragmentos (Figura 2). Teóricamente, TUNEL debería ser más sensible y lineal para la identificación de la fragmentación inicial (baja) del ADN que la escalera de ADN o el cometa, los cuales tienen un período de retraso de acumulación de pequeños fragmentos de alta movilidad. En cualquier caso, los estudios que combinan TUNEL con el cometa )41,42] o la escalera de ADN [43,44] tienen la ventaja de detectar la fragmentación temprana del ADN con la máxima sensibilidad.

Aplicaciones TUNELTUNEL se utiliza para identificar y cuantificar la lesión renal en estudios clínicos y toxicológicos básicos en una amplia gama de aplicaciones, que incluyen tratamientos médicos [45], ambientales [46], agrícolas [41] e industriales [47], exposiciones y animales [48]. ] y ciencias de la alimentación [49]. TUNEL es aplicable a todos los tipos de células, órganos y especies que tienen ADN y ADNasas, lo que incluye casi todas las especies. TUNEL se ha utilizado para identificar y cuantificar la lesión renal en una amplia gama de animales, incluidos el pez cebra [50], el pez arroz japonés [51], los pollos [48], los jerbos [52], los ratones [41], las ratas [45], rabb its [53], minicerdos [54] y humanos [55]. Una ventaja importante de TUNEL es que se puede utilizar tanto en células cultivadas fijadas como en tejidos fijados. Esto proporciona consistencia metodológica para la comparación entre los resultados in vitro e in vivo en estudios en los que se pueden investigar los mecanismos en células de riñón cultivadas, mientras que las implicaciones in vivo se evalúan en los riñones de animales. También se puede utilizar cualquier elemento intermedio entre células enteras y tejidos, incluidos esferoides de células cultivadas [56] y cortes de riñón ex vivo [57,58].

La intensidad de TUNEL en términos de intensidad de la señal o el número de células positivas para TUNEL puede variar entre especies dependiendo de la actividad de las ADNasas. En nuestra experiencia, el riñón de rata tiene una ADNasa I más activa que el riñón de ratón, y la intensidad de la señal positiva de TUNEL se correlaciona con esto. Cuando se compara el riñón con otros órganos, su señal positiva de TUNEL es muy intensa y similar a la de otros órganos con alta actividad de ADNasa I, como el intestino y la glándula salival. En el otro extremo del espectro, la intensidad de la señal positiva de TUNEL más baja se observa en el cerebro y en las células tumorales/cancerosas, donde la expresión de la ADNasa I es probablemente inactivada por corte y empalme alternativo en la región codificante [59]. La señal positiva de TUNEL se observa en todos los tipos de células en el riñón. En promedio, el epitelio tubular se daña con más frecuencia que los glomérulos, especialmente en lesiones agudas (Figura 3A). Esto se correlaciona bien con la actividad de ADNasa I que prevalece en este tipo de células. A juzgar por las diferencias de sexo y edad observadas en nuestros experimentos, la ADNasa I es más abundante y activa en los machos que en las hembras y en los animales de mediana edad en comparación con los animales viejos o los neonatos. Sin embargo, no es evidente una diferencia clara en la positividad de TUNEL en relación con el sexo o la edad, probablemente porque el o predominante es predominante por otros factores. En algunos modelos renales (como el de isquemia-reperfusión), se induce la DNasa I [9]; mientras que en otros no se suprime e incluso se puede suprimir (por ejemplo, en la toxicidad del cisplatino) [10]. Se ha demostrado que la activación de las endonucleasas, si están presentes, ocurre dentro de las primeras 24 horas después de la lesión renal [9,60,61]. Por lo tanto, no fue sorprendente que al menos la mitad de las aplicaciones de TUNEL en la investigación renal en esta revisión se usaran para la lesión renal aguda (IRA), ya que la evaluación de la IRA a menudo se realiza dentro de las 24 a 72 horas posteriores a la lesión, cuando las endonucleasas son más activas. . La lista de estudios de AKI es larga e incluye lesiones tóxicas, sépticas, de trasplante e hipóxicas. En este trabajo, analizamos los modelos, los tipos de exposición, los tratamientos, los plazos de evaluación y los tipos de células afectados en estos estudios. Los estudios que se examinaron cubrieron modos agudos y agudos-crónicos mixtos de lesión renal y enfermedad renal crónica.

El hecho de que se observe una lesión renal con una señal positiva de TUNEL en los túbulos o en los glomérulos depende del tipo de agente dañino o enfermedad. Por ejemplo, se describió que la nefritis lúpica en humanos y el daño por nanopartículas de níquel tienen señales estrictamente positivas para TUNEL glomerular [62,63]. Por otro lado, la nefropatía diabética inducida por isquemia-reperfusión y estreptozotocina en ratas produjo células positivas para TUNEL solo en los túbulos [64,65]. Los túbulos proximales, el asa de Henle, los túbulos distales y los conductos colectivos suelen ser TUNEL positivos en los modelos de isquemia-reperfusión. Se describieron células positivas para TUNEL tanto en los glomérulos como en los túbulos en ratas expuestas a fármacos como ciclosporina A [66] y doxorrubicina [67] o materiales de productos de consumo como nanopartículas de óxido de zinc [68] y en un modelo de diabetes mellitus en ratas [ 69]. La LRA inducida por choque séptico en humanos también se asoció con células TUNEL positivas tanto glomerulares como tubulares [70]. la obstrucción del intestino delgado de asa cerrada estrangulada causó TUNEL-positividad en el riñón en 3 horas [87].

AKI puede ocurrir después del trasplante y las lesiones hipóxicas. El rechazo del aloinjerto en humanos se asocia comúnmente con la elevación de células positivas para TUNEL [88,89]. Después de la isquemia fría, las células positivas para TUNEL generalmente se observaron dentro de las 2 a 24 horas durante la reperfusión [90], o más estrechamente, entre 14 y 17 horas después de la isquemia [91], y a veces todavía se observan hasta 7 días después de la reperfusión. rechazo del trasplante [92]. De manera similar, en modelos de isquemia-reperfusión, las células positivas para TUNEL se observaron con mayor frecuencia 24 h después de la reperfusión [44,93,94], o dentro del rango entre 4 [95,96] y 72 h [97]. Tanto en estudios de LRA isquémica como de trasplante, las células positivas para TUNEL se localizaron en células epiteliales tubulares distales y proximales [44,93]. en ratonriñonesdespués de la lesión por isquemia-reperfusión, las células positivas para TUNEL se describieron como concentradas en la unión corticomedular, el objetivo habitual de la lesión isquémica [98].

Se observaron lesiones mixtas agudas y crónicas, en las que las exposiciones tóxicas, los estados de enfermedad y/o las evaluaciones fueron tanto agudas (es decir, horas, días) como crónicas (es decir, semanas, meses, años) en el mismo estudio en seres humanos trasplantados. rechazo (biopsia de 1 semana a 3 años después del trasplante) [88], infección por el virus de la hepatitis E porcina (7 y 14 días después de la inoculación) [52], estrés inducido por neumoperitoneo con CO2 en pacientes hidronefróticosriñones(2 semanas de hidronefrosis, 2 días después del neumoperitoneo) [53], glomerulonefritis proliferativa mesangial inducida por veneno de serpiente (1 a 14 días después de la inyección) [99], obstrucción ureteral unilateral (1 a 14 días de obstrucción) [100], exposición al acetato de uranilo (1 a 28 días de exposición) [101], nefropatía por ácido aristocólico (exposición diaria de 5 y 30-días) [102] e hiperoxia neonatal (probada de 1 a 60 días después del nacimiento, expuesta a hiperoxia primero 14 días) [103]. Catorce días después del impacto es un momento de evaluación muy común para este tipo delesiones renales[52,53,99,101,103]. En la mayoría de los casos, las células positivas para TUNEL se localizaron en túbulos y conductos colectivos. La única excepción fue la toxicidad del veneno de serpiente, que dañó principalmente los glomérulos [99].

Crónicoriñón(ERC), definida como la presencia deriñóndaño o disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG) en humanos durante más de 3 meses, también es un tema común para la evaluación TUNEL, que puede determinar si la ERC está asociada conDaño en el riñón.La ERC más estudiada en la que se aplica TUNEL es la nefropatía diabética. La lesión identificada por TUNEL-positividad ocurrió en túbulos y podocitos [69] en pacientes diabéticos con inicio de diabetes antes de la prueba TUNEL que varió de 7 a 30 años [104,105] y de 2 a 16 semanas después del tratamiento con estreptozotocina en roedores [106,107]. Se informó una histopatología TUNEL positiva similar en la nefropatía por inmunoglobulina A [22]. En la nefritis lúpica y la glomerulonefritis membranoproliferativa, la positividad de TUNEL se observó principalmente en los glomérulos [62,108,109]. Por otro lado, los estudios de seguridad de fármacos de cisplatino [110], cloroquina [45], doxorrubicina [67], finasteride [23], tacrolimus [111] y levetiracetam [24] observaron principalmente daño tubular. Asimismo, la lesión aguda continua identificada por células tubulares positivas para TUNEL se describió en estudios de nefropatía por ácido úrico [112], deficiencia de metionina [48], exposición a toxinas ambientales microcistina-LR [50] y cadmio [113], y en asociación con inducida por oxalato de calcioriñónpiedras [114] y nanopartículas calcificantes [115]. Si bien la identificación del daño renal progresivo durante la ERC mediante el ensayo TUNEL es una herramienta de diagnóstico útil, la combinación del ensayo TUNEL con la inmunohistoquímica (IHC) quizás sería aún más informativa para determinar el mecanismo de la lesión.

Técnicas de Cuantificación y Colocalización TUNEL

Los métodos de cuantificación de TUNEL varían. En la mayoría de los informes, las células/núcleos positivos para TUNEL se cuantifican como el porcentaje del total de células/núcleos [83,116,117]. Esto parece lo correcto, aunque es probable que la cantidad de células positivas para TUNEL no se corresponda exactamente con la cantidad de células muertas. Algunas células pueden no haber alcanzado niveles identificables de fragmentación del ADN, mientras que otras ya podrían haber sido eliminadas por los macrófagos. También se utiliza la cuantificación del número de células positivas para TUNEL por unidad cuadrada (mm2) [118], pero este método parece menos preciso porque depende de la ubicación y el tipo de contenido celular de las áreas. Las secciones corticales contienen principalmente glomérulos, túbulos, vasos sanguíneos y rayos medulares, mientras que las secciones medulares contienen principalmente asas de Henle, conductos colectores y vasos sanguíneos. La cuantificación "por Fifield" ciertamente depende de cuál sea el campo [72,119], y la cuantificación "por sección" es, aún más, indefinida [61,120]. Las mediciones mal identificadas, como "puntuación histológica" [121], "índice apoptótico" [113], "tasa de apoptosis" [92], "porcentaje de apoptosis" [122] o porcentaje de control no tratado [123,124], parecen ser aún menos apropiados, y dificultar la interpretación y no compararla con la mayoría de los estudios.

La muerte celular en las células vecinas comienza de manera desigual porque depende de la vascularización, el ciclo celular y otras variables. Esto a menudo da como resultado una tinción TUNEL desigual de las células en el tejido [45,96,125]. Sorprendentemente, la intensidad general de la señal positiva de TUNEL no se usa para la medición de TUNEL, a pesar de que depende directamente del grado de fragmentación del ADN. Esto quizás se deba a que las células se consideran muertas independientemente de la intensidad de la señal de TUNEL, ya que una célula no puede estar "más muerta" si la tinción de TUNEL es más intensa. Aunque es difícil comparar estudios que utilizan una amplia variedad de métodos para cuantificar los resultados de TUNEL, la cantidad de células positivas para TUNEL en los animales de control suele ser inferior al 2 % [75,99,100,116,126]. Una lesión aguda se asocia con un aumento de ~5–40x en la positividad de TUNEL [79,126,127]. Durante la lesión crónica, el aumento de células positivas para TUNEL es ligeramente menor, ~220-veces, [29,43,65] en comparación con los controles no tratados.

El ensayo TUNEL inicial basado en la tinción con diaminobencidina (DAB) se diseñó para microscopía óptica [14,15]. Este método tradicional todavía se usaba en dos tercios de los estudios examinados en esta revisión y en la gran mayoría de los estudios de biopsias humanas. La cuantificación se realiza mediante el recuento manual de células y, aunque es precisa, requiere mucho tiempo. A menudo, la cuantificación no se usa en absoluto y los resultados se presentan usando imágenes de muestras tratadas y teñidas como simple evidencia de que se produjo la muerte celular. La automatización puede acelerar el proceso de cuantificación [128,129]. Sin embargo, DAB no se puede combinar con ninguna otra tinción en la misma muestra y, por lo tanto, TUNEL basado en DAB solo puede proporcionar el número de células muertas, sin ninguna identificación del tipo de célula (excepto reconocimiento visual) o mecanismo de muerte celular.

Mientras que los estudios en humanos se basan abrumadoramente en TUNEL basado en DAB usando microscopía de luz, aproximadamente la mitad de los estudios en animales usan microscopía fluorescente FL (Figura 3). TUNEL fluorescente es visualmente atractivo, fácil de interpretar y tiene varias ventajas importantes. Además de la cuantificación precisa mediante la identificación de núcleos positivos para TUNEL o la intensidad media del color, la señal TUNEL fluorescente FL se puede colocar con otros colores para histoquímica (p. ej., DAPI) (Figura 3A) o IHC (Figura 3B). En este último, el uso de marcadores de proteínas puede ayudar a identificar señales positivas de TUNEL asociadas con diferentesriñóncompartimentos o dar información sobre el tipo de muerte celular. No pudimos encontrar ningún ejemplo de TUNEL combinado con doble tinción de anticuerpos IHC. Si bien tal combinación sería muy informativa, por ejemplo, para la identificación de un mecanismo de muerte celular en ciertos tipos de células, las dificultades técnicas asociadas con dicha tinción pueden superar los beneficios.

Identificacion deriñóntipo de célula ciertamente no es un problema para un experimentadoriñónpatólogo [104]. Debido a esto, el uso de marcadores adicionales para la identificación del tipo celular, por ejemplo, el uso de CD31 para la identificación de células endoteliales [130], es raro. Sin embargo, a menudo se utiliza el uso de marcadores de proteínas IHC para la caracterización de lesiones tisulares. La mayoría de los estudios utilizan la positividad de TUNEL como única evidencia de apoptosis. En otros estudios, el reconocimiento de que la positividad de TUNEL no es específica para la apoptosis ha llevado a que muchos marcadores morfológicos (p. ej., tinción con hematoxilina y eosina o ácido peryódico de Schiff), bioquímicos y de IHC se combinen con la tinción de TUNEL para confirmar la apoptosis. El marcador más utilizado para la apoptosis dependiente de caspasa es la caspasa escindida (activa)-3 mediante el uso de un anticuerpo que no reconoce la caspasa de tamaño completo-3 [131,132]. Tanto el ensayo TUNEL como el de caspasa escindida-3 mostraron tinción exclusivamente tubular, no glomerular, en la isquemia-reperfusión de rata [64]. Otros estudios de caspasa usaron caspasa-1 [27], -9 [53], -11 [28] y -12 [75]. Otros marcadores apoptóticos incluyeron la familia de proteínas del linfoma de células B 2 (Bcl2) Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] y Bad [43]; receptor apoptótico Fas [52] y receptor apoptótico-ligando FasL [66]; factores de transcripción de la proteína forkhead box (FOX) Fox01 [133] y Fox03 [27]; y citocromo c [53]. La inflamación se identificó mediante IHC del factor de necrosis tumoral alfa (TNF) [134]; factores de crecimiento tumoral TGF [66] y TGF- 1 [135]; serina/treonina quinasa 1 (SGK1) [135]; flavoproteína de transferencia de electrones, subunidad beta (ETF) [136]; Janus quinasa-2 (JAK2) [137]; transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) [137]; potenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear de las células B activadas (NF-κB) [137] y su proteína inhibidora IκB [137]. Parariñónevaluación de lesiones, molécula de lesión renal-1 (KIM-1) [24], canal de acuaporina-1 (AQP-1) [45], factor inducible por hipoxia {{7} }factor de transcripción alfa (HIF-1 ) [103], transportador de aminoácidos de tipo Asc-1 (Asc-1) [121], diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) [131] quinasa , y transglutaminasa II [89]. La lesión renal oxidativa se estudió con marcadores como 8-hidroxiguanosina (8OHdG) [102], lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) [102], sirtuina desacetilasa dependiente de NAD-1 (SIRT1) [138] , y la hemooxigenasa 1 (HO-1) [90]. Las quinasas se estudiaron intensamente, incluida la vía de la quinasa N-terminal (JNK) c-Jun [101], la fosfoinositida 3-quinasa/proteína quinasa B/factor nuclear eritroide 2-factor de transcripción relacionado con el factor 2 (PI3K/ Akt/Nrf2) [46], pannexin-1 (PANX1) proteína de unión hendida de la membrana plasmática [26] y proteína quinasa activada por mitógeno/quinasa regulada por señal extracelular (MAPK/ERK) [26]. Los estudios de endonucleasas apoptóticas involucraron DNasa activada por caspasa (CAD) [139], DNasa I [108] y EndoG [139], y los marcadores de daño en el ADN incluyeron proteína tumoral p53 (p53) [99] y proteína 1 relacionada con dinamina (PARP1 ) [66]. Algunos estudios también encontraron útil la evaluación de la apoptosis mediada por estrés del retículo endoplásmico y la lesión tisular [75].

Dada la gran cantidad de estudios mecanicistas encuestados y la ventaja de combinar TUNEL con marcadores IHC para la identificación de mecanismos de muerte celular, uno esperaría muchos estudios que utilicen la colocalización entre los dos. El análisis se puede realizar mediante una colocalización píxel por píxel entre células positivas para TUNEL y marcadores IHC, intensidad media de marcador IHC en áreas positivas para TUNEL, o intensidad media de señal positiva para TUNEL en áreas positivas para marcador IHC. Desafortunadamente, esta ventaja de TUNEL se ha utilizado solo en unos pocos estudios. Las células positivas para TUNEL se colocalizaron con caspasa escindida-3 enriñóntúbulos durante la toxicidad del paracetamol en ratas [74]. La colocalización IHC con señal positiva de TUNEL permitió la identificación de la muerte celular de las células mesangiales durante la nefritis de Habu [99]. En microscopía óptica, la colocalización con marcadores mecanísticos de toxicidad se realizó en secciones seriadas, según lo informado por Ott et al. [89].

Problemas y limitaciones de TUNEL

Varios problemas potenciales pueden ocurrir y deben esperarse cuando se trabaja con TUNEL. Una es que los terminales de ADN 30OH ocurren no solo durante la muerte celular como resultado de la acción de la endonucleasa, sino también como un metabolito intermedio normal en casi todas las reacciones enzimáticas con el ADN. Una función celular primaria que produce terminales 30OH es la síntesis de ADN, en la que numerosos fragmentos de Okazaki pueden teóricamente producir una señal TUNEL falsamente positiva, especialmente en modificaciones altamente sensibles del ensayo. Durantelesión renal,La reparación del ADN también puede contribuir a señales positivas falsas de TUNEL como resultado de la acción de una endonucleasa AP. La lesión renal oxidativa masiva inducida por una lesión química (peróxido de hidrógeno, bleomicina) o física (irradiación gamma) puede aumentar el número de extremos 30OH, lo que aumenta las lecturas de TUNEL falsos positivos además de la fragmentación del ADN mediada por endonucleasas.

Más a menudo y más probablemente, las condiciones experimentales establecidas incorrectamente de la reacción de TdT (tiempo, temperatura, actividad enzimática o cofactores) pueden dar como resultado una señal de fondo positiva de TUNEL artificialmente elevada. Aunque sigue sin definirse lo que se considera la línea de base normal para las muestras de tejido renal no tratadas, parece plausible que alrededor del 1 por ciento del total de células sea un número razonable. Ciertamente, un fondo del 10 por ciento o más es una clara evidencia de condiciones de ensayo no caracterizadas y sin refinar o una desviación de las condiciones de almacenamiento de muestra apropiadas.

Otro problema a esperar es la baja actividad de ADNasa I en algunos tipos de células (p. ej., endotelio),riñóncompartimentos (p. ej., glomérulos) o tejidos patológicos (p. ej., tumores). Se debe esperar que estas células muestren una baja positividad de TUNEL, no porque sean resistentes a las lesiones, sino porque no hay suficiente actividad de endonucleasa para producir una señal medible en TUNEL. En nuestra experiencia, incluso los cambios entre {{0}}.01 por ciento y 0.1 por ciento de células positivas para TUNEL pueden ser estadísticamente significativos y usarse como evidencia sólida de lesión renal (o de otro tejido).

Finalmente, surge un problema con la cuantificación de la tinción TUNEL cuando la cantidad de fragmentación del ADN es demasiado alta, por ejemplo, en las últimas etapas de la muerte celular o en lesiones de alta intensidad, donde el ADN restante no se puede contrateñir adecuadamente con DAPI debido al desmontaje del doble hélice (Figura 3D). En estos casos, las señales positivas de TUNEL están "colgando en el aire" y aparentemente no están asociadas con un núcleo. Se convierte en responsabilidad de un patólogo interpretarlas como células positivas para TUNEL en lugar de un artefacto. Con TUNEL marcado con fluoresceína, existe el peligro de identificar la autofluorescencia de fondo en el tejido como positividad de TUNEL [140]. En estos casos, se recomienda cambiar a TUNEL de espectro rojo [51,54].

Patrones TUNEL como fuente de información adicional

Varios patrones TUNEL pueden distinguirse claramente y usarse para determinar un mecanismo potencial y el grado de lesión (Tabla 1, Figura 3). Por lo general, un tipo de patrón TUNEL de solo núcleos se produce por una lesión leve, mientras que una lesión más fuerte (es decir, una exposición elevada) da como resultado una tinción más fuerte y la desintegración de los núcleos o las células. Un patrón TUNEL estrictamente apoptótico es la fragmentación nuclear como resultado de la formación de cuerpos apoptóticos (Figura 3E). Se observaron pequeños fragmentos de núcleos positivos para TUNEL, que probablemente son cuerpos apoptóticos, en la isquemia-reperfusión de ratas a las 24–72 h [97]. También se observaron cuerpos apoptóticos con marcaje TUNEL de núcleos en el epitelio tubular renal y el intersticio 14 días después de la lesión por isquemia-reperfusión en ratas [141]. Las dosis crecientes de aceite de lavanda redujeron los patrones TUNEL de solo núcleos y los convirtieron en TUNEL similares a necrosis con fuga citoplasmática [94]. Este último fue el resultado de la destrucción de la envoltura nuclear debido a la acción de proteinasas y lipasas en la necrosis. Se observó TUNEL citoplasmático (Figura 3F) visto como un citoplasma positivo para TUNEL en microscopía óptica en el modelo de rabdomiolisis en túbulos de rata [142] y en podocitos cultivados en presencia de glucosa alta y en nefropatía diabética en ratones [135]. El TUNEL citoplasmático también se describió en la isquemia-reperfusión renal en ratones usando TUNEL fluorescente FL [98] y en la isquemia-reperfusión en ratas usando microscopía óptica [143]. Daño profundo y exclusivamente tubular inducido por cloruro de mercurio con fuerte tinción TUNEL citoplasmática indicativa de daño de la membrana nuclear [60]. Si la lesión continúa o la dosis del agente dañino aumenta, el TUNEL citoplasmático puede convertirse en una imagen "desordenada" de TUNEL disperso (Figura 3G) atribuido a etapas tardías de destrucción celular debido a necrosis y derrame de citoplasma celular y desechos. Por ejemplo, se observó TUNEL citoplasmático y disperso en ratones [71,72] y ratas [144] tratados con cisplatino, y en lesiones de podocitos en ratas diabéticas inducidas con estreptozotocina [145]. También se observó TUNEL necrótico disperso durante la nefrotoxicidad inducida por acetato de uranilo en ratones [101]. Por último, otra variable de la señal de TUNEL a la que se debe prestar atención es la intensidad de las señales positivas de TUNEL, que pueden desviarse de una célula a otra dependiendo del número de rupturas (grado de lesión) que experimente cada célula, según lo documentado por algunos estudios [45,96,125 ]. Para los modelos en los que se observa una intensidad variable de la señal TUNEL, se recomienda la cuantificación tanto por el número de objetos positivos para TUNEL como por la intensidad media de la tinción.

Conclusiones

Debido a la alta actividad de las endonucleasas apoptóticas en el riñón, particularmente DNasa I y EndoG, el uso de TUNEL parainvestigación y diagnóstico renales muy informativo Puede volverse aún más útil si TUNEL se aplica más allá de su uso inicial como método para identificar la apoptosis. La aplicación de TUNEL exclusivamente para estudios de apoptosis es un buen ejemplo de cómo la ciencia puede ser desviada inadvertidamente por un método utilizado de manera inapropiada. A pesar de su uso principalmente como ensayo de lesiones agudas, TUNEL se puede aplicar con éxito para evaluar tanto la LRA como la ERC. Sin embargo, en la ERC, se debe esperar que el grado de positividad de TUNEL sea menor que en la lesión aguda. Debido a que la actividad de las endonucleasas (principalmente, la ADNasa I) es mucho mayor en el epitelio tubular que en otros compartimentos renales, la lesión de los túbulos renales suele verse como más prominente. Sin embargo, las lesiones glomerulares o vasculares también pueden estudiarse mediante TUNEL si la lesión se produce realmente en estos compartimentos. La colocalización de TUNEL fluorescente FL con marcadores IHC permite la identificación y asociación de tipos celulares y mecanismos de muerte celular con señales TUNEL. La cuantificación de TUNEL puede aportar información valiosa sobre el grado de muerte celular, y la aplicación de software de análisis de imágenes puede ser muy útil en este sentido. Teniendo en cuenta la variedad de patrones TUNEL, se recomienda encarecidamente imágenes representativas para establecer y demostrar

Señales TUNEL que se consideran positivas. Finalmente, los patrones TUNEL deben usarse como fuente de información adicional, como el mecanismo de muerte celular y el grado de toxicidad. Por ejemplo, distinguir entre cuerpos apoptóticos positivos para TUNEL, la presencia de señales TUNEL citoplásmicas o patrones TUNEL dispersos puede ayudar a identificar células positivas para TUNEL apoptóticas y necróticas para interpretaciones más precisas de los resultados de investigación y diagnóstico.

tratamiento del trastorno renal de la excitación sexual