Extracción, propiedades fisicoquímicas, actividades antienvejecimiento y antioxidantes de polisacáridos de residuos de cáñamo industrial Parte 1
Jul 10, 2023
Abstracto: Una gran cantidad de polisacáridos de cáñamo permanecen en los residuos de cáñamo industrial (IHR) después de la extracción de cannabidiol, lo que resulta en el desperdicio de recursos. Por lo tanto, el estudio sistemático de los polisacáridos del cáñamo es beneficioso para el desarrollo del RSI en el futuro. En este estudio, la extracción de polisacáridos de residuos de cáñamo industrial (IHRP) se optimizó mediante un experimento de un solo factor y un diseño experimental ortogonal. Las condiciones óptimas de extracción por calor fueron temperatura de extracción 98 ◦C, relación sólido-líquido 1:10, tiempo de extracción 1 h, número de extracciones sucesivas 2 y pH 4. La relación de extracción y el contenido de polisacáridos fueron 20.12 ± 0.55 por ciento y 12.35 ± 0.26 por ciento en las condiciones, respectivamente. Además, las mejores condiciones de precipitación del alcohol fueron bombeo con 2 L/h, agitación continua y baño de agua con hielo durante 4 h. Los IHRP brutos se purificaron adicionalmente mediante cromatografía en columna y los contenidos de polisacáridos/proteínas de los IHRP purificados fueron 34,44 por ciento y 1,61 por ciento. Los IHRP se componían principalmente de diez monosacáridos y algunos componentes distintos del azúcar, incluidos ácidos orgánicos, flavonoides, esteroides y glucósidos. El FT-IR demostró el esqueleto de polisacáridos de los IHRP. Además, las tasas de eliminación de DPPH y ABTS de los IHRP fueron del 76,00 por ciento y del 99,05 por ciento a las concentraciones de 1 mg/ml. Los IHRP podrían promover la proliferación de células epidérmicas y la curación de rasguños celulares. Mientras tanto, los IHRP podrían promover la expresión de genes relacionados con el envejecimiento. En general, los IHRP podrían ser una fuente natural deseable de antioxidantes y productos antienvejecimiento en muchos aspectos.
El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y puede eliminar las especies reactivas de oxígeno, prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.
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Palabras clave: cáñamo industrial; polisacárido; extracción; actividad antioxidante; actividad antienvejecimiento
1. Introducción
El cáñamo (Cannabis sativa L.), una hierba anual de la familia Cannabis, se ha utilizado durante miles de años [1]. El contenido de tetrahidrocannabinol (THC) del cáñamo industrial es inferior al 0.3 por ciento en peso, que es diferente de la marihuana medicinal y la marihuana recreativa [2,3]. Por lo tanto, el cáñamo industrial podría cultivarse legalmente a gran escala. La composición química del cáñamo industrial es muy compleja e incluye cannabinoides, terpenoides, alcaloides y flavonoides [4]. Los compuestos más bioactivos son los cannabinoides que incluyen más de 130 compuestos fenólicos terpenos que se acumulan principalmente en las puntas de las flores [5]. Los principales cannabinoides son THC, cannabidiol (CBD), cannabinol (CBN), cannabigerol (CBG), cannabidivarin (CBDV), cannabidiol (CBT) y cannabicyclol (CBL) [6]. Entre ellos, el THC, un compuesto psicoactivo restringido en diferentes países, y el CBD son los cannabinoides más estudiados por sus importantes bioactividades [7], como actividades neuroprotectoras, antiepilépticas, anticancerígenas e inmunorreguladoras [8]. La existencia de estos compuestos aumenta la importancia del cáñamo industrial. En la actualidad, el cáñamo industrial se ha utilizado ampliamente en los campos de la química diaria, los materiales, la energía y la medicina [9]. El tratamiento actual de los residuos de cáñamo industrial (IHR) es desecharlos directamente, lo que no solo contamina el medio ambiente sino que también provoca un desperdicio de recursos [10].
El polisacárido es un polímero que consiste en más de 10 monosacáridos [11]. Es una de las macromoléculas biológicas más esenciales. En los últimos años, muchos artículos han informado que los polisacáridos naturales de las plantas tienen buenas actividades biológicas, que incluyen actividades anticancerígenas [12], antiinflamatorias [13], antioxidantes [14], inmunomoduladoras [15], hipoglucemiantes [16] y antivirales. [17]. La composición molecular y la estructura espacial de los polisacáridos generalmente tienen efectos significativos en sus propiedades y actividades [18]. Con el desarrollo de la tecnología de separación, purificación y análisis estructural de polisacáridos, generalmente se acepta que los polisacáridos tienen grandes valores de aplicación en los campos de medicamentos, cosméticos y alimentos [19]. El contenido de polisacáridos de los residuos de cáñamo industrial es de alrededor del 10 al 15 por ciento. Los polisacáridos de cáñamo tienen muchas propiedades fisicoquímicas excelentes porque contienen muchos hidroxilos hidrofílicos, como una fuerte capacidad de absorción de agua, propiedades emulsionantes y una buena capacidad de formación de películas. Mientras tanto, los polisacáridos de cáñamo tienen efectos de retención de humedad, antibacterianos y no tóxicos. Por lo tanto, tienen amplias perspectivas de aplicación en el campo cosmético. Los productos fermentados de polisacáridos de cáñamo (oligosacáridos o algunos alcoholes de azúcar), que tienen buenas actividades antioxidantes, antienvejecimiento y antifatiga, se han utilizado para desarrollar bebidas funcionales [20]. La composición de los polisacáridos del cáñamo es relativamente compleja y varía desde monosacáridos hasta 5 × 104 Da polisacáridos.
Hay pocos informes sobre la separación y extracción de polisacáridos de cáñamo. Hillestad et al. aisló dos glicoproteínas del cáñamo. La estructura de enlace de la cadena de glucósido y la conexión entre la cadena y la proteína se analizaron mediante metilación y degradación de Smith [21]. JW Groce et al. midió el contenido de carbohidratos del cáñamo cultivado en los Estados Unidos, Tailandia y Vietnam, respectivamente. Se señaló que existían grandes diferencias en el tipo y contenido de compuestos entre los cultivares de diferentes áreas [22]. Zheng et al. analizó la composición de monosacáridos y la estructura de HSP0 y HSP0.2, dos componentes del polisacárido de semilla de cáñamo, mediante HPLC y FT-IR. Se encontró que tanto HSP0 como HSP0.2 contenían radicales sulfato [23]. Bi et al. obtuvo dos polisacáridos de semilla de cáñamo HS1 y HS2 por cromatografía de filtración en gel. Los principales monosacáridos fueron D-arabinosa, D-xilosa, D-manosa, D-galactosa y D-glucosa, y sus proporciones molares fueron 0.12, 0.09 , 0.15, 0.11 y 0.12, respectivamente [24]. Guo et al. preparó polisacáridos de hojas de cáñamo industrial y estudió los efectos de la luz ultravioleta, la temperatura y el pH en su actividad antibacteriana. Se encontró que la concentración mínima bactericida y la concentración mínima de inhibición de los polisacáridos contra S. aureus fueron de 6.25 y 3.125 mg/mL, respectivamente. Además, la actividad antibacteriana fue más alta cuando el pH fue de 7.
En este estudio, el IHR después de la extracción de cannabidiol se utilizó como materia prima para la extracción de polisacáridos. Se optimizó el proceso de extracción y purificación de polisacáridos de residuos de cáñamo industrial (IHRP). Luego se analizó la estructura y composición de los IHRP. Además, se evaluó la capacidad de eliminación de ABTS y DPPH de los IHRP. También se estudió su actividad antienvejecimiento a nivel celular. Se espera que los IHRP puedan usarse ampliamente en los campos de los cosméticos y los alimentos funcionales.
2. Resultados y Discusión
2.1. Experimentos de extracción de factor único para IHRP
2.1.1. Efectos de los métodos de extracción en la extracción de polisacáridos
Los efectos de la extracción por percolación, la extracción por calentamiento y la extracción asistida por ultrasonidos en la extracción de polisacáridos se muestran en la Figura 1a. Se pudo ver que el contenido de polisacáridos de la extracción por percolación estaba cerca del 0 por ciento, lo que indicaba que casi no se extraía ningún polisacárido y que el extracto consistía principalmente en pigmento y otros componentes solubles en agua. Los resultados se debieron a que la extracción por percolación fue muy suave y la pared celular de IHR no se rompió. Por tanto, los polisacáridos no podían extraerse de las células, lo que provocaba que el contenido de polisacáridos y la tasa de extracción de la extracción por percolación fueran muy bajos. La relación de extracción de la extracción por calentamiento fue mayor que la de la extracción asistida por ultrasonidos. Sin embargo, el contenido de polisacáridos de la extracción por calentamiento (11,27 por ciento) fue menor que el de la extracción asistida por ultrasonidos (13,81 por ciento). La extracción por calentamiento es uno de los métodos de extracción más utilizados debido a la simplicidad y bajo costo del proceso. Sin embargo, el tiempo de extracción por calentamiento es relativamente largo y la tasa de extracción no es alta. La temperatura de extracción generalmente tiene una gran influencia en la relación de extracción. La mayor tasa de extracción de la extracción por calentamiento en este trabajo se debió a que la extracción por calentamiento se realizó a 98 ◦C, mientras que la extracción asistida por ultrasonidos se realizó a 60 ◦C. La extracción asistida por ultrasonido podría acortar el tiempo de extracción porque el efecto de cavitación y el efecto mecánico podrían destruir las paredes celulares, mejorar la penetración del solvente y acelerar la transferencia de polisacáridos al solvente [25]. Por lo tanto, el contenido de polisacáridos de la extracción asistida por ultrasonidos fue mayor que el de la extracción por calentamiento. Se eligió la extracción por calor para los siguientes experimentos dada la simplicidad del proceso y la industrialización.
2.1.2. Efectos de la temperatura de extracción en la extracción de polisacáridos
Los efectos de la temperatura de extracción en la extracción de polisacáridos se muestran en la Figura 1b cuando la relación sólido-líquido fue 1:10, el tiempo de extracción fue 1 h, el número de extracciones sucesivas fue 2 y el pH fue 7. La relación de extracción y el contenido de polisacáridos fueron ambos aumentó con el aumento de la temperatura. Cuando la temperatura fue de 98 ◦C, la relación de extracción y el contenido de polisacáridos más altos fueron 14,99 por ciento y 12,03 por ciento, respectivamente.
2.1.3. Efectos de la relación sólido-líquido en la extracción de polisacáridos
Cuando la temperatura de extracción fue de 98 ◦C, el tiempo de extracción fue de 1 h, el número de extracciones sucesivas fue de 2 y el pH de 7, los efectos de la relación sólido-líquido en la extracción de polisacáridos se muestran en la Figura 1c. La relación de extracción aumentó gradualmente con una relación sólido-líquido de 1:6 a 1:10 y luego se volvió uniforme. Sin embargo, el contenido de polisacáridos casi no se vio afectado por la relación sólido-líquido. Además, la solución podía simplemente sumergir la materia prima cuando la relación sólido-líquido era de 1:5 debido a la baja densidad de las hojas de las plantas. Por lo tanto, se estudió principalmente la relación sólido-líquido de 1:6.
2.1.4. Efectos del pH en la extracción de polisacáridos
Cuando la temperatura de extracción fue de 98 ◦C, el tiempo de extracción fue de 1 h, el número de extracciones sucesivas fue de 2 y la relación sólido-líquido fue de 1:10, los efectos del pH en la extracción de polisacáridos se muestran en la Figura 1d. Cuando la solución se acidificó o alcalinizó gradualmente, la relación de extracción mejoró hasta cierto punto. Sin embargo, el contenido de polisacáridos tuvo una tendencia decreciente con el aumento del pH, lo que indicó que la condición ácida fue beneficiosa para la extracción de IHRP.
2.1.5. Efectos del tiempo de extracción en la extracción de polisacáridos
Cuando la temperatura de extracción fue de 98 ◦C, el pH de 7, el número de extracciones sucesivas de 2 y la relación sólido-líquido de 1:10, los efectos del tiempo de extracción sobre la extracción de polisacáridos se muestran en la Figura 1e. La relación de extracción disminuyó ligeramente cuando el tiempo de extracción superó 1 h. Además, el contenido de polisacáridos casi no fue influenciado por los diferentes tiempos de extracción.
2.1.6. Efectos del número de extracciones sucesivas en la extracción de polisacáridos
Cuando la temperatura de extracción fue de 98 ◦C, el tiempo de extracción de 1 h, el pH de 7 y la relación sólido-líquido de 1:10, los efectos de varias extracciones sucesivas sobre la extracción de polisacáridos se muestran en la Figura 1f. La tasa de extracción cayó al 5,11 por ciento cuando la materia prima se extrajo por segunda vez. Además, el contenido de polisacáridos fue muy bajo cuando la materia prima se extrajo por tercera vez.
2.2. Diseño Experimental Ortogonal de Extracción para IHRPs
It could be seen that extraction temperature, solid–liquid ratio, number of successive extractions, and pH had a great influence on polysaccharide extraction based on the single-factor experiments. Therefore, the orthogonal experiments were carried out to further optimize the extraction conditions. As shown in Table 1, the order of effect of individual factors on polysaccharide extraction was: extraction temperature > several successive extractions>relación sólido-líquido > pH. El grupo 5 (relación sólido-líquido fue 1:8, el número de extracciones sucesivas fue 3, la temperatura de extracción fue 80 ◦C y el pH fue 4) tuvo el mayor contenido de polisacáridos (12,79 por ciento), mientras que el grupo 9 (relación sólido-líquido fue 1 :10, el número de extracciones sucesivas fue 2, la temperatura de extracción fue 98 ◦C y el pH fue 4) tuvo el segundo contenido más alto de polisacáridos (12.26 por ciento). Considerando el consumo energético y la operatividad, se realizó la validación comparativa entre los grupos 5 y 9 para determinar las condiciones de extracción más adecuadas. Como se muestra en la Tabla 2, los experimentos verificados mostraron que el contenido de polisacáridos entre los grupos 5 y 9 era muy parecido. Así, para ahorrar consumo de energía, se seleccionaron las condiciones de extracción del grupo 9 para extraer IHRPs para su uso en los siguientes experimentos: relación sólido-líquido 1:10, temperatura de extracción 98 ◦C, número de extracciones sucesivas 2 y El pH era 4.
2.3. Pantalla de IHRPs Condiciones de Precipitación de Alcohol
La solución de extracción de IHRP se obtuvo de acuerdo con las condiciones de extracción optimizadas por 2.2. Los efectos de las diferentes condiciones de precipitación del alcohol se muestran en la Tabla 3. En comparación con la adición única y la agitación durante 0.5 h, el bombeo y la agitación continuos podrían mejorar aún más el contenido de polisacáridos. Sin embargo, el efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el contenido de polisacáridos no fue evidente. Por lo tanto, se eligieron las condiciones de precipitación con alcohol del grupo 4 para la preparación de IHRP.
2.4. Rendimiento de polisacáridos y composición química de IHRP purificados
Los IHRP brutos se decoloraron y purificaron mediante adsorción con carbón activado, filtración por membrana, cromatografía en columna y método de separación, respectivamente. Como se muestra en la Figura 2, el tratamiento con adsorción de carbón activado al 8 por ciento tuvo el mejor efecto decolorante, seguido por el tratamiento de cromatografía en columna. Además, el método de orillo y la filtración por membrana casi no tuvieron efecto decolorante. Teniendo en cuenta la industrialización y la simplicidad del proceso, se utilizó la cromatografía en columna con resina de intercambio aniónico para purificar los IHRP en este manuscrito. Además, como se muestra en la Tabla 4, el peso de los IHRP fue de 15,26 g cuando la purificación se realizó después de la precipitación con alcohol, mientras que el peso de los IHRP fue de 12,74 g cuando la purificación se realizó directamente después de la extracción por calentamiento. Sin embargo, el peso real de polisacáridos de los dos procesos fue muy similar (4,69 gy 4,38 g). Por lo tanto, para ahorrar costos, la purificación por cromatografía en columna podría llevarse a cabo directamente después de la extracción por calentamiento.
2.5. Espectroscopia FT-IR de IHRP
Algunas características estructurales de los polisacáridos podrían inferirse en función de los picos de absorción característicos de FT-IR [26]. El espectro FT-IR de los IHRP se muestra en la Figura 3 y se pudo observar la absorción típica del polisacárido. El pico alrededor de 3378 cm−1 se atribuyó a la vibración de estiramiento de -OH, lo que indica la existencia de -OH [27]. El pico débil a 2932 cm−1 fue la vibración de estiramiento de CH, incluida la vibración de -CH2 y -CH3 [28]. El pico fuerte en alrededor de 1600 cm−1 se relacionó con la vibración de estiramiento de -C=O [29], y el pico alrededor de 1413 cm−1 se denotó para la vibración de estiramiento de CO, lo que indica la existencia de -COOH. Además, el pico relativamente fuerte a 1080 cm−1 muy probablemente corresponde a la vibración de flexión OH. El espectro FT-IR de los IHRP mostró muchos picos de absorción característicos de polisacáridos, lo que demuestra el esqueleto de polisacáridos de los IHRP.
2.6. Análisis de composición de monosacáridos de IHRP
La bioactividad de los polisacáridos está frecuentemente relacionada con las composiciones de monosacáridos. En este estudio, la composición de monosacáridos de los IHRP se adquirió mediante cromatografía iónica como se muestra en la Figura 4. De acuerdo con los estándares de monosacáridos, los IHRP estaban compuestos de fucosa, arabinosa, ramnosa, galactosa, glucosa, xilosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido gulurónico, y ácido glucurónico. Sus porcentajes de calidad fueron 1,33, 19,60, 10,41, 20,87, 27,42, 4,23, 3,12, 6,22, 0,28 y 2,37 respectivamente. Se pudo encontrar que arabinosa, ramnosa, galactosa y glucosa fueron los principales monosacáridos en los IHRP. La glucosa fue un monosacárido dominante en los IHRP y el resultado fue consistente con el estudio anterior [30]. El contenido de ácido urónico podría haber hecho que los polisacáridos se cargaran negativamente. Este resultado tuvo una influencia significativa en las bioactividades de los polisacáridos [31]. Además, el contenido de polisacáridos de los IHRP estaba entre el 30 y el 35 por ciento. Los componentes distintos del azúcar fueron principalmente ácidos orgánicos, flavonoides, esteroides y glucósidos. Mientras tanto, el contenido de cada componente sin azúcar fue relativamente bajo.
2.7. Estudio de actividad antioxidante
La capacidad de eliminación de radicales libres de ABTS y DPPH se ha estudiado ampliamente para evaluar la actividad antioxidante de los polisacáridos [32]. La capacidad de eliminación de IHRP contra ABTS y DPPH se muestra en la Tabla 5. Como se muestra en la Tabla 5, la tasa de eliminación de DPPH y ABTS aumentó con el aumento de la concentración de IHRP. Cuando la concentración de IHRP fue de 1.0 mg/ml, la tasa de eliminación de DPPH fue del 76.00 por ciento, mientras que la tasa de eliminación de ABTS fue del 99.{{10}}5 por ciento . Después del cálculo, los valores EC50 de ABTS y DPPH se determinaron como 0.34 y 0.47 mg/mL. Hasta donde sabemos, no hay ningún informe sobre la actividad antioxidante de los IHRP. Se estudió la actividad antioxidante de las inflorescencias de 12 cultivares monoicos de Cannabis sativa L. [33]. Entre ellos, la piña tuvo la actividad de eliminación más fuerte contra DPPH (EC50=60.00 µg/mL) mientras que Kc-Virtus tuvo la capacidad de eliminación más fuerte contra ABTS (EC50=304.77 µg/ ml). En cuanto a la actividad antioxidante del aceite de espectro completo de cannabidiol, se informó que su DPPH EC50 fue de 158,0 µg/mL [34]. Además, se informó que el DPPH EC50 de CBD era de 0,937 mM [35]. También se estudió la capacidad de captación de radicales libres del CBDV, es decir, el ABTS EC50 fue de 406,3 µM mientras que el DPPH EC50 fue de 3736 µM [36]. Los resultados anteriores indicaron que los IHRP mostraron una gran actividad antioxidante.
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