El estado actual de la neuroprotección en las cardiopatías congénitas, parte 3

3.2. Evaluación semicuantitativa del ADN mitocondrial ectópico

Las imágenes de tinción con Hsp60 (la matriz mitocondrial) y la tinción con histona-H2B (el marcador nuclear) se restaron de las imágenes de tinción de ADNbc. Luego, utilizando la función "AdjustThreshold" del software lmage] (Institutos Nacionales de Salud), se binarizaron las imágenes.

Las mitocondrias son las fábricas de energía de las células, responsables de sintetizar ATP para proporcionar la energía que necesitan las células. La matriz mitocondrial es el líquido interno de las mitocondrias, que contiene una variedad de enzimas e iones y es un sitio clave para diversas reacciones bioquímicas de las mitocondrias. La memoria es una de las capacidades cognitivas más importantes del ser humano. Aunque los dos pueden parecer no relacionados, están estrechamente relacionados.

Las investigaciones muestran una interacción entre la matriz mitocondrial y la memoria. Las enzimas y los iones de la matriz mitocondrial pueden afectar directamente la excitabilidad de las neuronas al regular el metabolismo energético y el estado de los canales iónicos en las células neuronales, afectando así la memoria. Además, hay una variedad de moléculas de señalización en la matriz mitocondrial, que pueden transmitirse a las neuronas posteriores a través de los axones y las sinapsis de las neuronas, lo que afecta la eficiencia de transducción de señales de las neuronas y afecta así la formación y consolidación de la memoria.

Al mismo tiempo, la actividad de la memoria también afecta directamente al estado de la matriz mitocondrial. Las actividades de la memoria aumentarán el consumo de energía de las neuronas y promoverán la reacción redox en la matriz mitocondrial, afectando así el nivel metabólico de las mitocondrias y el equilibrio iónico intracelular, afectando aún más la excitabilidad y la eficiencia de transducción de señales de las neuronas.

Por lo tanto, mantener una buena salud mitocondrial es crucial para mantener una buena función de la memoria. Manteniendo buenos hábitos de vida, como una dieta regular, ejercicio moderado, sueño adecuado, etc., puedes ayudar a mantener la salud de la matriz mitocondrial. Además, la función de la memoria también se puede mejorar mediante una intervención farmacéutica adecuada para promover reacciones bioquímicas y señalización dentro de la matriz mitocondrial.

En la vida diaria podemos ejercitar la memoria de muchas formas, como leyendo, estudiando, pensando, jugando, etc. Al mismo tiempo, también debemos prestar atención a mantener una buena salud para mantener mejor la salud de la matriz mitocondrial. Creo que a través de estos esfuerzos, seguramente tendremos mejor memoria y afrontaremos mejor los diversos desafíos de la vida y el trabajo. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche deserticola también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Seleccionamos puntos de ADNds con un tamaño de 2 a 20 um' (circularidad 0.1-1.0) utilizando la función "Analizar-Analizar partículas". de ser necesario, se examinaron las imágenes originales para el recuento final. Si la señal de la histona H2B era pequeña. luego, las imágenes restadas mostraron estructuras en forma de rosquilla.

Estos representan ADNds citosólico de origen nuclear y deben eliminarse de la cantidad de ADNds citosólico de origen mitocondrial. El rango de tamaño puede modificarse según el tipo celular o el origen de las muestras histológicas. La Figura lE muestra un ejemplo del recuento de ADN mitocondrial ectópico.

puntos usando 1B D.

Alternativamente, las imágenes de tinción con Hsp60 se restaron de las imágenes de tinción de ADNbc. Luego, se contó el número de puntos de ADNds utilizando las funciones "Ajustar-Umbral" "Analizar-Analizar partículas". Posteriormente, se contaron los puntos de ADNds sin la señal de histona-H2B mediante observación directa. Este último método es adecuado cuando las imágenes de histona-H2B muestran una relación señal-ruido baja.

En conjunto, este método puede mostrar claramente el ADN mitocondrial ectópico que se filtra hacia el citoplasma y permite una evaluación objetiva y estadística de dicho ADN mitocondrial ectópico en las células.

4. Discusión

En nuestro estudio, desarrollamos un método que permite el recuento de ADN mitocondrial citoplasmático. Se ha informado sobre la detección de ADN mitocondrial citoplasmático mediante técnicas de inmunofluorescencia, pero los métodos no fueron cuantitativos para la evaluación del ADN mitocondrial citoplasmático en la mayoría de los casos [15, 25]. En otro estudio, se realizó una PCR en gotas para cuantificar el ADN mitocondrial circulante [9].

Recientemente, Sato et al. [26,27] publicaron un excelente protocolo para evaluar el ADN citoplasmático mediante microscopía de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos Lamin B1 (LMNB1) como marcador de estructura nuclear y subunidad 4 de citocromo c oxidasa (COX4) como marcador de estructura mitocondrial. Este protocolo parece muy útil para cuantificar el dsDNA citoplasmático de origen nuclear.

Sin embargo, cuando probamos la COX4 u otros marcadores de membrana mitocondrial, incluidos marcadores internos y externos, fue muy difícil discriminar con precisión el citoplasma de las mitocondrias.

Por ejemplo, si observamos señales circulares usando un marcador de membrana mitocondrial y observamos señales de ADNds en su interior, entonces este ADNds podría representar ADN mitocondrial dentro de las mitocondrias circulares (normal) o ADN mitocondrial citoplasmático fuera de las mitocondrias en forma de rosquilla (ectópico). Por lo tanto, utilizamos Hsp60 como marcador que marca la matriz mitocondrial para evaluar el ADN mitocondrial ectópico en el citoplasma.

Como se describe en una revisión reciente [23], existen muchos tipos diferentes de ADN citoplasmático de origen nuclear, y la mayoría de ellos son positivos para marcadores de histonas. Debido a la limitación de la combinación de anticuerpos utilizados para la triple tinción, utilizamos la histona H2Ba como marcador de histonas.

Sin embargo, si se resuelve esta limitación, H2AX puede ser un mejor marcador para el ADNbc citoplasmático de origen nuclear. Rara vez se observó ADNds citoplásmico negativo para histona-H2B en las células HeLa de control utilizadas en este estudio, pero dicho ADNds de origen nuclear puede estar presente si se utilizan otras líneas celulares o condiciones.

La hibridación in situ del ADN mitocondrial utilizada en nuestro artículo reciente es adecuada para la evaluación cualitativa, pero puede resultar difícil utilizar la hibridación in situ para la evaluación cuantitativa [8].

La hibridación in situ expone el ejemplar a altas temperaturas, lo que puede provocar deformaciones o ruidos en algunas partes del ejemplar. Por otro lado, el método inmunocitoquímico presentado en este artículo puede obtener señales con poco ruido de fondo. En nuestro artículo reciente, en células humanas y de pez cebra utilizadas como modelos de la enfermedad de Parkinson, demostramos que el ADN mitocondrial se filtraba hacia el citoplasma, lo que es tóxico para el organismo. células. También observamos que la cantidad de ADN mitocondrial citosólico aumentó en los tejidos cerebrales post-mortem de pacientes con enfermedad de Parkinson [8].

Estas líneas de evidencia sugieren que una mayor cantidad de ADN mitocondrial ectópico filtrado de las mitocondrias puede inducir inflamación aguda y crónica que resulta en diversas enfermedades, incluida la enfermedad de Parkinson y la insuficiencia cardíaca; por lo tanto, la regulación positiva de la degradación del ADN citosólico o la inhibición de sus sensores podría ser un objetivo terapéutico potencial para estas enfermedades [8, 28].

El método presentado en este artículo para la evaluación cuantitativa del ADN mitocondrial ectópico sirve como una herramienta importante para futuras investigaciones en este campo.

Contribuciones de los autores: HM y MTH formularon las hipótesis, diseñaron la mayoría de los experimentos, realizaron los experimentos, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. NM realizó los experimentos relacionados con células cultivadas. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiamiento: este trabajo fue apoyado por subvenciones de AMED (números de subvención JP21gm6110028 y JP19dm0107154 (HM)), Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (números de subvención JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) y JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; número de subvención JPMJMS2024 (HM)) y subvenciones de TBRF (número de subvención TBRF-RF 21-135 (HM)).

Declaración de disponibilidad de datos: los datos y las herramientas descritos en este manuscrito están disponibles previa solicitud.

Agradecimientos: Agradecemos a Shinano Kobayashi por participar en debates útiles y brindar apoyo continuo. Agradecemos a la Fundación de Investigación Bioquímica de Tokio (TBRF) por brindar una beca postdoctoral TBRF para investigadores extranjeros para MH (TBRF-RF 21-135).

Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Referencias

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2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. El reconocimiento del genoma del herpesvirus indujo la acetilación del IFI16 nuclear es esencial para su translocación citoplasmática, inflamasoma e IFN-respuestas. Patógeno PLoS. 2015, 11, e1005019. [Referencia cruzada] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, Nuevo México; Cena, Licenciatura en Letras; Hancks, CC; Elde, Carolina del Norte; Cristea, IM; Knipe, DM La estabilización mediada por cGAS de IFI16 promueve la señalización innata durante la infección por el virus del herpes simple. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. EE.UU. 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

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10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, diputado; Croteau, DL; Bohr, VA La suplementación con NAD(+) reduce la neuroinflamación y la senescencia celular en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer mediante cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Ciencia. EE.UU. 2021, 118, e2011226118.

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