El efecto protector de la quercetina sobre las células endoteliales dañadas por la hipoxia y la reoxigenación

Para mas informacion contactetina.xiang@wecistanche.com

Fondo: La enfermedad de pequeños vasos cerebrales (CSVD, por sus siglas en inglés) es un grupo de síndromes clínicos que abarca todos los procesos patológicos de los pequeños vasos del cerebro, que pueden causar accidentes cerebrovasculares y demencia grave. Sin embargo, como la patogenia de la CSVD no está clara, el tratamiento es limitado. La disfunción de las células endoteliales es más temprana que los síntomas clínicos, como la hipertensión y la leucosis. Por lo tanto, se espera que el tratamiento de las células endoteliales sea un nuevo avance.quercetina, un flavonoide presente en una variedad de plantas, tiene la función de anti-inflamación y anti-oxidación. Este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto protector de la quercetina sobre la lesión de las células endoteliales y proporcionar una teoría básica para su aplicación posterior en la clínica.

Métodos: Se cultivaron células endoteliales microvasculares de cerebro humano (HBMEC) in vitro y se estableció el modelo de daño de las células endoteliales mediante hipoxia y reoxigenación (H/R). Los efectos protectores de la quercetina sobre las HBMEC se estudiaron desde la perspectiva de la viabilidad celular, la migración celular, la angiogénesis y la apoptosis. Con el fin de estudiar más a fondo el mecanismo de la quercetina,estrés oxidativoy el estrés del retículo endoplásmico fueron analizados. Además, también se estudió la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB).

Resultados: quercetinapuede promover la viabilidad, la migración y la angiogénesis de las HBMEC e inhibir la apoptosis. Además, la quercetina también puede activar la vía de señalización Keap1/Nrf2 y reducir la expresión de la proteína ATF6/GRP78. Estudios posteriores demostraron que la quercetina podría aumentar la expresión de Claudin-5 y Zonula occludens-1.

Conclusiones: Nuestros experimentos muestran que la quercetina puede proteger las HBMEC de H/R, que contiene la promoción de la proliferación celular, la migración celular y la angiogénesis, reduciendo el daño potencial de la membrana mitocondrial e inhibiendo la apoptosis celular. Esto puede estar relacionado con su antioxidación e inhibición del estrés del retículo endoplásmico. Al mismo tiempo, la quercetina puede aumentar el nivel de conexina BBB, lo que sugiere que la quercetina puede mantener la integridad de la BBB.

Palabras clave: enfermedad cerebral de vasos pequeños, células endoteliales, quercetina, estrés oxidativo, estrés del retículo endoplásmico, barrera hematoencefálica

INTRODUCCIÓN

Enfermedad de pequeños vasos cerebrales(CSVD) es un término genérico que abarca todos los procesos patológicos que involucran los vasos pequeños en el cerebro y se refiere a un grupo de síndromes clínicos, de imagen y patológicos con diversas etiologías que contienen las arteriolas intracraneales a las vénulas (diámetro<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

quercetinaes un flavonoide presente en varias plantas, como Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc tiene fuertes actividades antioxidantes y antiinflamatorias y puede ejercer efectos protectores en varias condiciones patológicas, incluyendo enfermedades cardiovasculares, trastornos metabólicos, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, cáncer y obesidad (Dok-Go et al, 2003; Comalada et al, 2005; Cho y otros, 2006). El pretratamiento con quercetina aumentó significativamente los niveles de expresión de enzimas antioxidantes endógenas en las neuronas piramidales CA1 del hipocampo de animales lesionados por isquemia, mostrando fuertes efectos antioxidantes y neuroprotectores (Chen et al, 2017). Estudios recientes también han encontrado que la quercetina tiene efectos neuroprotectores contra la lesión isquémica mientras mantiene la integridad de la BBB (Jin et al, 2019). Sin embargo, su efecto sobre las células endoteliales microvasculares del cerebro (BMEC) bajo lesión por hipoxia y reoxigenación (H/R) está poco estudiado, y no se ha informado sobre la proteína diana de la quercetina que protege a las BMEC.

En nuestro estudio, exploramos el efecto protector de la quercetina en las células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) lesionadas por H/R en cultivo. Al mismo tiempo, estudiamos más a fondo el posible mecanismo de su efecto protector, a fin de proporcionar una base más teórica para la promoción clínica de la quercetina y brindar nuevas ideas para el tratamiento de la CSVD.

MATERIALES Y MÉTODOS

Medios, reactivos y anticuerpos

quercetina(purity>98 por ciento) fue adquirido de Best Biological Technology Co, Ltd. (Chengdu, China). Los HBMEC se compraron a Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Shanghai, China). El suero bovino fetal (FBS) se obtuvo de Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel). Penicilina/estreptomicina y medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) se adquirieron de Hyclone (GA, Estados Unidos). El kit de prueba de potencial de membrana mitocondrial (JC-1), el kit de prueba de proteína BCA, el diacetato de 2,7-dicloruro-hidrofluoresceína (DCFH-DA) y el lisado NP40 se compraron a Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). La preparación de fosfatasa y el inhibidor de proteasa completo se adquirieron de Roche (Shanghai, China). El kit de apoptosis se adquirió de BD Biosciences (Sparks, MD, Estados Unidos). Malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), molécula de adhesión celular intercelular-1 (ICAM-1), molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM{{10}} )ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) fue (Cambridge, Abcam compró la empresa dfrom1" 一Reino Unido). El factor de transcripción activador 6 (ATF6), la proteína regulada por glucosa 78 (GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH se adquirió de Cell Signaling Technology (Danvers, Estados Unidos). La IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) se obtuvo de Jackson Company (Pennsylvania, Estados Unidos). El kit de dispensación rápida SDS-PAGE y la solución cromogénica ECL se compraron de EpiZyme Biotechnology (Shanghai, China). Cultivo celular y modelo de lesiones HBMEC se cultivaron en DMEM que contenía 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina, en una incubadora a 37 °C con 5 por ciento de CO2. daño celular, las HBMEC se trataron con 12 h de hipoxia seguida de 8 h de reoxigenación, y los procedimientos específicos fueron los siguientes (Warpsinski et al., 2020): las HBMEC se incubaron primero con el medio sin suero en una incubadora de hipoxia (1 por ciento O,5 por ciento de CO, 94 por ciento de N) durante 12 h, y luego se cambió el medio a medio normal que contenía 10 por ciento de FBS, mientras se incubaban en una incubadora de normoxia (95 por ciento de O2, 5 por ciento de CO2) durante 8 h. Tratamiento con quercetina Se disolvieron 2 mg de quercetina en 331 μL de DMSO para formar una solución madre con una concentración de 1 mmol/L y se almacenó a -20 grados. La solución de trabajo se diluyó a 0,1, 0,5, 1,2,5, 10 umol/l con DMEM, en la que el porcentaje de DMSO estaba por debajo del 0,1 por ciento. Una vez adheridas las células, se añadió quercetina con el medio libre de suero y posteriormente las placas se colocaron en la incubadora de hipoxia. Después de 12 h, las células se retiraron, se cambiaron a quercetina con medio de suero y se colocaron en una incubadora de normoxia durante 8 h.

Ensayo de viabilidad celular

Los efectos dequercetinasobre la viabilidad de los HBMEC fueron examinados por Cell Counting Kit-8 de acuerdo con el manual del operador. Primero se evaluaron las dosis seguras de quercetina para las células en ausencia de daño a las células endoteliales, y luego se probaron los efectos protectores de la misma en la condición de daño celular. Todos los resultados experimentales se repitieron al menos tres veces.

Ensayo de cicatrización por arañazos y formación de tubos Los experimentos de migración se realizaron usando un método de arañazos celulares. Antes del tratamiento con quercetina, se dibujó una línea recta perpendicular en la parte inferior de la placa de cultivo y se fotografió para grabar durante 0 h, y las células se sometieron posteriormente a tratamiento con quercetina y modelado antes de tomar fotografías para grabar. Las áreas anterior y posterior se contrastaron dos veces.

Formación de tubos que imitan la capacidad angiogénica celular, el Matrigel (9-12mg/ml) se colocó en la parte inferior de la placa de cultivo, luego se sembraron en la parte superior quercetina y células tratadas con modelado, después de 8 h, se tomaron fotografías. La generación de ramificación de vasos sanguíneos se analizó y comparó utilizando ImageJ.

Ensayo de potencial de membrana mitocondrial y apoptosis

El cambio de potencial de membrana mitocondrial y el kit de apoptosis se utilizaron para detectar la apoptosis celular. La alteración del potencial de la membrana mitocondrial se detectó mediante la tinción de HBMEC con sonda fluorescente JC-1. Se añadió la solución de trabajo de tinción JC-1(1×) y se incubó en una incubadora de 37 grados C durante 20 minutos antes de lavarla dos veces con tampón de tinción JC-1(1×) y finalmente se agregó a cada pocillo para PBS . Luego, se usó el generador de imágenes de celdas de alto contenido para el análisis.

Los HBMEC se recolectaron de las 6-placas de pocillos, se centrifugaron para eliminar el sobrenadante, luego se agregó 1 × solución de unión de anexina V para soplar y mezclar las células, luego se agregó colorante FITC de anexina V para incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min, agregue la solución de tinción de yoduro de propidio (PI) 5 min antes de la máquina, y se empleó el citómetro de flujo Beckman para detectar.

ELISA

Después de tratar las células con H/R o quercetina, se recogió el sobrenadante. ICAM-1, VCAM-1, SOD y MDA se detectaron utilizando kits ELSA de acuerdo con el manual del operador.

Ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) La capacidad de generación de ROS fue detectada por la sonda DCFH-DA, que fue evaluada por el generador de imágenes de células de alto contenido y analizada por fluorescencia utilizando ImageJ. Transferencia occidental

Se recogieron HBMEC de placas de cultivo, se usó preparación de fosfatasa con adición de lisado NP40 e inhibidor de proteasa completo para extraer proteínas de las células. Se determinó el contenido de proteína y se tomaron 30 ug de proteína para experimentos de inmunotransferencia. El gel SDS-PAGE se usó para la electroforesis, se bloqueó con leche descremada en polvo al 5 por ciento después de la electrotransferencia a una membrana de PVDF durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego anti-Nrf2(conejo, 1:1,000),anti-Keapl(conejo,1:1,000),anti-ATF6(conejo,1:1,000 ), anti-GRP78(conejo,1:1,000), anti-ZO-1(conejo,1:1,000), anti-Claudin-5( conejo, 1:1, 000) se incubaron durante la noche a 4ºC. Después de lavar al día siguiente, se añadieron anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo diluidos (IgG HRP, 1:10, 000) y se incubaron durante 1 hora. Finalmente, la detección se desarrolló después de tres lavados en TBST.

Análisis proteómico

Los HBMEC se trataron con H/R en presencia de quercetina (1 umol/l). Posteriormente, las células se rasparon suavemente de la placa de cultivo con un raspador de células, se recogieron en crioviales, se colocaron rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 grados durante 5 min. Se utilizó la tecnología iTRAQ para realizar el análisis proteómico, el proteínas con valor p<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 o<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Análisis estadístico

Los datos se ajustaron con una distribución normal y se utilizó la media ± desviación estándar para expresar los datos. Se utilizó GraphPad Prism 8 para el análisis estadístico. Se analizaron dos muestras independientes mediante la prueba t y los datos de medición se describieron mediante la media ± desviación estándar (DE). La comparación entre grupos se realizó mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA). valor p<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

RESULTADOS

Resultados

Efecto de la quercetina sobre la viabilidad celular

Para probar el efecto de la quercetina en la viabilidad celular, primero examinamos una dosis segura de quercetina en las células, como se muestra en la Figura 1A, que no tuvo impacto en la viabilidad celular a 0.1-10 umol/L . A continuación, para buscar una dosis efectiva sobre la base del daño de las células endoteliales, mostramos que la quercetina en 0.1-1 μmol/L podría promover la viabilidad celular en H/R-HBMEC, como se muestra en la Figura 1B. Los experimentos posteriores se llevaron a cabo alrededor de este rango de concentración. Cabe señalar que cuando la concentración del fármaco alcanzó los 10 μmol/L, apareció la citotoxicidad. Pensamos que cuando los HBMEC fueron dañados por H/R, su tolerancia disminuye. Por lo tanto, cuando la concentración del fármaco era ligeramente superior, aumentaba el daño a las células. Por lo tanto, la citotoxicidad ocurrió cuando la concentración del fármaco es de 10 μmol/L.

Efecto de la quercetina sobre la migración celular y la angiogénesis

Para examinar los efectos de la quercetina sobre las capacidades migratorias y angiogénicas de las células endoteliales, las HBMEC se sometieron a un tratamiento H/R mientras se administraba quercetina. Realizamos un ensayo de rascado para probar la capacidad de migración celular, que mostró que el tratamiento con H/R debilitó la capacidad de migración de H/R-HBMEC en comparación con el control, y que la quercetina podría promover significativamente la migración celular a una concentración de 0 .1-1 µmol/L. La tubulogénesis se utilizó para imitar la angiogénesis in vitro, y la longitud de su rama representa la capacidad angiogénica. Los resultados mostraron que el tratamiento con H/R resultó en una capacidad angiogénica reducida, pero la quercetina 0.1-1 μmol/L podría revertir esta lesión, como se muestra en la Figura 2.

Efecto de la quercetina sobre la apoptosis celular

Para probar el potencial de la quercetina para inhibir la apoptosis de las células endoteliales, empleamos el potencial de membrana mitocondrial y la apoptosis para la evaluación. Cuando las células se lesionaron para sufrir eventos apoptóticos, el potencial de la membrana mitocondrial se redujo, la fluorescencia roja citoplasmática se redujo significativamente, la fluorescencia verde aumentó y finalmente se adoptó el rojo/verde (R/G) para representar la alteración del potencial de la membrana mitocondrial, que disminuirá cuando el potencial de la membrana mitocondrial se vea comprometido. Nuestros resultados mostraron que después del tratamiento con H/R, el potencial de membrana mitocondrial de las células disminuyó, como lo indica el aumento de la fluorescencia verde. Con dosis crecientes de quercetina, la fluorescencia roja aumentaba constantemente, lo que indica que la quercetina puede elevar el potencial de la membrana mitocondrial de forma dependiente de la dosis (Figura 3A, C). Además, se empleó la citometría de flujo para examinar directamente la apoptosis celular. Los resultados mostraron que las HBMEC exhibieron una tasa elevada de apoptosis después del tratamiento con H/R, mientras que la quercetina a 0.1-1 umol/L exhibió una clara capacidad para inhibir la apoptosis (Figura 3B, D).

Efecto de la quercetina sobre la adhesión celular

Una vez que se dañan las células endoteliales, se producen algunas moléculas de adhesión, como ICAM{{0}} y VCAM-1, que absorben sustancias tóxicas en la BBB y dañan el parénquima cerebral (Hauptmann et al, 2020 ). Para examinar el efecto de la quercetina sobre la capacidad de H/R-HBMEC para producir moléculas de adhesión, se midieron ICAM-1 y VCAM-1 usando ELISA. En nuestro estudio, H/R resultó en un aumento de los niveles de ICAM-1 y VCAM-1, pero la adición de quercetina a una concentración de 0,1-1 umol/L disminuyó este efecto (Figura 4).

La quercetina podría inhibir el estrés oxidativo

La quercetina es un flavonoide con gran capacidad antioxidante, por lo que empleamos una sonda DCFH-DA para detectar ROS. Nosotros observamos

aumento de la generación de ROS en HBMEC expuestos a H/R, que se redujo notablemente con el tratamiento con quercetina a concentraciones de {{0}}.1-1 umol/L Mientras tanto, detectamos cambios en el nivel de estrés oxidativo productos SOD y MDA con ELISA, y los resultados mostraron que la quercetina en la concentración de 0.1-1 μmol/L fue capaz de disminuir SOD y MDA, que estaban elevados por H/R, lo que indica que la quercetina podría reducir la daño de HBMEC por estrés oxidativo (Figura 5).

La quercetina podría regular las proteínas Keap1/Nrf2 y ATF6/GRP78

Para explorar más a fondo el mecanismo protector de la quercetina en HBMEC, analizamos los niveles de expresión deestrés oxidativoy proteínas relacionadas con el estrés del retículo endoplásmico. Se sabe que Keap1/Nrf2 regula las respuestas antioxidantes in vivo. La lesión por estrés oxidativo obliga a las células endoteliales a sufrir una respuesta de estrés, lo que da como resultado un aumento de los niveles de Keapl/Nrf2 (Warpsinski et al, 2020). En el presente estudio, H/R dio como resultado la activación de los mecanismos de respuesta antioxidante celular y el aumento de los niveles de Keapl y Nrf2, que podrían fortalecerse aún más con la quercetina a 0,5-1 umol/L para mejorar la capacidad antioxidante de las HBMEC. .ATF6/GRP78 es una de las vías que regulan la homeostasis del retículo endoplásmico (RE). El estrés del RE puede agravar la lesión de las células endoteliales (Nie et al, 2020). En nuestro estudio, el estrés del RE fue activado por H/R y los niveles de ATF6 y GRP78 aumentaron. La quercetina a 1 umol/L fue capaz de reducir significativamente los niveles de proteína de ambos, inhibir el estrés del RE y proteger las HBMEC de la lesión por H/R (Figura 6).

La quercetina podría mantener la integridad de BBB

Las BMEC son la columna vertebral de la estructura de la BBB, y su muerte o apoptosis después de una lesión por H/R afecta la integridad y la funcionalidad de la BBB (Ding et al, 2019). En este artículo, la función de las células endoteliales se reflejó mediante la detección de cambios en la expresión. de proteínas asociadas a BBB ZO-1 y Claudin-5. En comparación con el grupo de control, la expresión de ZO-1 y Claudin-5 fue

disminuyó la lesión H/R, lo que indica que la BBB se dañó y este daño podría revertirse con quercetina en concentraciones de 0.5-1 μmol/L, lo que indica que la quercetina puede mantener la función de las células endoteliales (Figura 7).

Análisis proteómico

Para encontrar las proteínas de expresión diferencial (DEP) de las HBMEC dañadas por H/R en presencia o no de quercetina, se utilizó ITRAO para realizar el análisis proteómico. Proteínas que exhiben ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 o<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

DISCUSIÓN

CSVD, como una carga médica y socioeconómica creciente, ha atraído rápidamente la atención. Pero, sorprendentemente, la patogenia de la CSVD sigue siendo oscura en la actualidad, y tampoco presenta un esquema claro para su tratamiento. Dado que las últimas etapas de la CSVD pueden progresar a resultados graves, como accidente cerebrovascular y demencia, el tratamiento de las lesiones tempranas puede retrasar de manera efectiva la progresión de la CSVD (Cannistraro et al, 2019). Se ha demostrado que los cambios patológicos tempranos de la CSVD radican en la disfunción de las células endoteliales y que los fármacos que estabilizan su disfunción pueden mejorar la vulnerabilidad de la sustancia blanca cerebral en las lesiones de la CSVD (Rajani et al, 2018). Dado el papel que desempeñan las células endoteliales en CSVD, nos propusimos investigar los efectos protectores de la medicina tradicional china sobre las células endoteliales utilizando HBMEC.

La quercetina es un flavonoide presente en una variedad de plantas (Nawrot-Hadzik et al, 2019). Tiene fuertes actividades antioxidantes y antiinflamatorias y puede ejercer efectos protectores en diversas condiciones patológicas. En este estudio, demostramos que la quercetina puede mejorar la lesión H/R, y varios datos experimentales confirman nuestra conclusión de que la quercetina puede promover la viabilidad celular, la migración celular, la angiogénesis, aumentar el potencial de la membrana mitocondrial e inhibir la apoptosis.

Teniendo en cuenta que la quercetina tiene una fuerte actividad antioxidante, investigamos el mecanismo por el cual la quercetina protege las HBMEC en términos de antioxidación. Los niveles de ROS pueden aumentar significativamente por el estrés oxidativo (Wu et al., 2018), y la acumulación de ROS puede causar muchas enfermedades, incluidas enfermedades cardiovasculares, disfunción endotelial y enfermedades relacionadas con el envejecimiento, y enfermedades neurodegenerativas (Chen et al, 2015; Jakaria et al., 2018; Santos et al., 2018). Además, el estrés oxidativo ocurre en la peroxidación lipídica, produciendo MDA, que destruirá el equilibrio antioxidante oxidativo del cuerpo y aumentará el daño de las células endoteliales (Yang et al, 2021).

Keapl/Nrf2 se considera la vía de estrés autoantioxidante más importante en la actualidad, y la activación de esta vía puede mejorar significativamente la disfunción de las células endoteliales. En particular, las ROS ayudan a promover la activación de la vía de señalización Nrf2 (Selimoglu-Buet et al, 2017). Hemos demostrado que la quercetina puede disminuir la generación de ROS y MDA, al tiempo que aumenta la expresión de las proteínas Keapl y Nrf2, lo que sugiere que la quercetina puede atenuar la lesión de las células endoteliales al disminuir las respuestas al estrés oxidativo mediante la activación de la vía de señalización Keapl/Nrf2.

No solo eso, el estrés sostenido del RE activa la respuesta de la proteína desplegada y altera la expresión de los genes antioxidantes, lo que lleva a la apoptosis de las células endoteliales (Tang et al, 2019). Además, el estrés oxidativo también puede causar la alteración del plegamiento de proteínas en el RE, provocar estrés en el RE y agravar la lesión de las células endoteliales (Hetz, 2012). El estrés del RE puede activarse mediante estas tres vías: la quinasa del RE de tipo PKR (PERK), la enzima que requiere inositol 1 (IRE1) y el ATF activador-6, que protegen a las células del estrés del RE en condiciones homeostáticas (Hetz et al. ,2020). Pero cuando se ven afectados por estímulos adversos externos, estas tres vías activarían la respuesta al estrés del RE e inducirían la apoptosis celular. Además, los estudios han demostrado que la inhibición de la respuesta al estrés del RE puede revertir la disfunción de las células endoteliales inducida por H/R (Chen et al, 2020). En nuestro estudio, la quercetina podría reducir el contenido elevado de ATF6/GRP78 causado por H/R, inhibir la respuesta al estrés del retículo endoplásmico y proteger las células endoteliales.

Como componente principal de la BBB, las funciones de las células endoteliales incluyen el mantenimiento de su integridad. La disfunción de la BBB provoca la fuga de líquidos, proteínas y otros componentes del plasma hacia los tejidos perivasculares, lo que afecta aún más la vasodilatación cerebral y el transporte de nutrientes (Wardlaw et al, 2019). Cuando las células endoteliales se dañan y la integridad de BBB se destruye, la protección de las células endoteliales puede mantener aún más la integridad de BBB.Claudin-5 se expresa mucho en BMEC y participa en la constitución de la columna vertebral de las cadenas de uniones estrechas para regular Permeabilidad BBB (Yang et al, 2020). Las células endoteliales están ancladas al citoesqueleto de actina mediante proteínas de andamiaje como ZO-1, lo que genera uniones estrechas entre las células endoteliales que mantienen la estanqueidad de la BHE (Zhang et al, 2020). En nuestro estudio, se utilizó la expresión de claudin-5 y ZO-1 para representar la integridad BBB. Nuestros resultados mostraron que los niveles de proteína de claudina-5 y ZO-1 se redujeron en las HBMEC sujetas a lesión por H/R, lo que indica que la integridad de la BHE se interrumpió y que la quercetina podría reducir esta lesión al elevar la claudina{{ 9}} y niveles de proteína ZO 1.

Además, para encontrar los objetivos potenciales de la quercetina en las HBMEC, se marcó i-TRAQ en las células. Después del análisis proteómico, se investigaron las 20 principales proteínas comunes expresadas diferencialmente. Entre ellos, INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI están relacionados con las células endoteliales. INSRR se considera un marcador endotelial tumoral y su sobreexpresión puede promover la angiogénesis (Nowak-Sliwinska et al, 2019). La ANXA2 recombinante puede reducir la permeabilidad endotelial en estados de lesión por factores hipóxicos e inflamatorios, lo que indica que la ANXA2 puede estar involucrada en el mantenimiento de la estanqueidad de las células endoteliales (Li et al, 2019). En la tinción de secciones cervicales humanas, se encontró una fuerte expresión de DUSP3 en las células endoteliales, y los experimentos también demostraron que DUSP3 es necesario para el crecimiento microvascular inducido por el factor de crecimiento de fibroblastos básico (Amand et al. 2014). Se ha demostrado que la expresión de HBAl en las células endoteliales controla el tono y la función vascular (Sangwung et al., 2017). También se cree que PGK1 reduce la aterogénesis (Zhang et al, 2020). Además, la VTN se considera crítica para la formación de trombos en el contexto de una lesión vascular (Bowley et al, 2017). El GPI está enriquecido en las células endoteliales microvasculares del tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide en un entorno hipóxico y regula la secreción del factor de crecimiento endotelial vascular de los fibroblastos sinoviales de la artritis reumatoide para inducir la angiogénesis (Lu et al, 2017). Además, el estudio de diferencialmente Las proteínas expresadas relacionadas con la infertilidad mediada por varicocele mostraron que Nrf2 era un regulador aguas arriba de ANXA2 (Panner Selvam et al, 2021). La inhibición de PGK1 puede activar la vía Keapl/Nrf2 y estimular la respuesta antioxidante protectora de las células (Bollong et al, 2018). Las dos proteínas pueden ser los objetivos potenciales de la quercetina a través de la vía Keapl/Nrf2. Estudios adicionales pueden verificar el papel de estas proteínas en el efecto de la quercetina en H/R-HBMEC.

Es cierto que la quercetina puede ejercer efectos protectores sobre las células endoteliales. Pero los objetivos específicos de acción aún requieren más investigación, y aún se desconoce si existen vías de acción adicionales.

En conclusión, este estudio demostró que la quercetina mantuvo la integridad de la barrera hematoencefálica al proteger las células endoteliales. A nivel molecular, la quercetina puede desempeñar un papel en la protección de las células endoteliales protegiendo contra el estrés oxidativo a través de la vía Keapl/Nrf2 e inhibiendo el estrés del retículo endoplásmico a través de la vía ATF6/GRP78. Este estudio sienta las bases para que la medicina tradicional china trate la CSVD mediante la protección de las células endoteliales.